论文部分内容阅读
TNF-α具有两种生物活性形式:跨膜型TNF-α（tmTNF-α）和分泌型TNF-α（s TNF-α）。tmTNF-α不仅可作为配体通过TNFR向靶细胞传递正向信号,还可作为受体向自身表达细胞传递反向信号。我们的前期工作证实白血病细胞高表达tmTNF-α可组成性活化NF-κB经典和非经典通路,导致其耐药。我们用自己研发的tmTNF-α单克隆抗体进行免疫共沉淀实验,首次发现tmTNF-α胞浆段可与TRAF1结合,募集IKKα和NIK等NF-κB通路的信号分子,不但激活NF-κB非经典通路,还可通过NIK依赖性的方式激活NF-κB经典通路。然而,TRAF1是如何转导tmTNF-α反向信号的尚不清楚。本课题拟研究TRAF1转导tmTNF-α反向信号组成性活化NF-κB通路的分子机制,进而探索靶向TRAF1能否阻断tmTNF-α反向信号,提高白血病细胞对化疗的敏感性。主要结果如下:一、TRAF1转导tmTNF-α反向信号组成性活化NF-κB通路的分子机制1.TRAF1通过其锌指结构域与tmTNF-α结合将野生型TRAF1、缺失或仅含有锌指结构域的TRAF1突变体真核表达质粒分别转染至稳转tmTNF-α的HEK293T细胞中,用tmTNF-α抗体进行免疫共沉淀实验,结果显示:野生型TRAF1和仅含有锌指结构域的22-57 TRAF1-FLAG突变体能与tmTNF-α结合,而缺失锌指结构域的Del 22-57 TRAF1突变体不能与tmTNF-α结合。该结果提示:TRAF1通过其锌指结构域与tmTNF-α结合。2.TRAF1通过其TRAF结构域的N端（TD-N）与IKKα结合将IKKα与TRAF1-FLAG、Del 22-57 TRAF1-FLAG、Del TD-N TRAF1-FLAG和Del TD-C TRAF1-FLAG突变体真核表达质粒共转染至稳转tmTNF-α的HEK293T细胞中,用IKKα抗体进行免疫共沉淀实验,结果显示:IKKα不能与Del TD-N TRAF1-FLAG突变体结合,可与其他TRAF1突变体结合。该结果提示:TRAF1通过其TRAF结构域N端与IKKα结合。3.TRAF1通过其TRAF结构域的C端（TD-C）与NIK结合将NIK与TRAF1-FLAG、Del 22-57 TRAF1-FLAG、Del TD-N TRAF1-FLAG和Del TD-C TRAF1-FLAG突变体真核表达质粒共转染至HEK293T细胞中,用NIK抗体进行免疫共沉淀实验,结果显示:NIK不能与Del TD-C TRAF1-FLAG突变体结合,可与其他TRAF1突变体结合。该结果提示:TRAF1通过其TRAF结构域C端与NIK结合。通过以上研究我们证实,TRAF1作为接头分子在tmTNF-α反向信号转导中发挥重要作用:TRAF1通过其锌指结构域与tmTNF-α胞浆段结合,又通过其TRAF结构域N端与IKKα结合,C端与NIK结合,导致NIK活化IKKα,进而组成性激活白血病细胞的NF-κB通路。二、靶向TRAF1阻断tmTNF-α反向信号可提高白血病细胞对化疗药物的敏感性1.tmTNF-α反向信号激活的NF-κB经典或非经典通路均参与白血病细胞对阿霉素的耐药性我们前期工作证实tmTNF-α反向信号不但可组成性活化NF-κB非经典通路,还可通过NIK依赖性的方式活化NF-κB经典通路。故我们分别用经典通路信号分子IκBα的特异性抑制剂BAY-11-7082和非经典通路信号分子p100的siRNA预处理tmTNF-α阳性的Raji细胞1 h和48 h后,再用不同浓度的阿霉素作用24 h,CCK-8实验检测细胞的杀伤效应,结果显示:无论是BAY-11-7082还是p100 siRNA都可明显提高Raji细胞对阿霉素的敏感性。提示tmTNF-α反向信号激活的NF-κB经典和非经典通路均参与白血病细胞对阿霉素的抵抗性。2.TRAF1结合肽体外阻断tmTNF-α反向信号组成性活化NF-κB,可提高白血病细胞对化疗药物的敏感性由于TRAF1锌指结构域与tmTNF-α结合,是启动tmTNF-α反向信号组成性活化NF-κB的第一步,故我们根据锌指结构域序列设计TRAF1结合肽（TBP）,并与HIV穿膜肽TAT连接,使之易于跨过细胞膜进入细胞内与tmTNF-α结合,推测其可竞争性阻断tmTNF-α与完整的TRAF1结合,进而抑制IKKα和NIK的募集,从而抑制tmTNF-α诱导的NF-κB经典和非经典通路的组成性激活,提高白血病细胞对凋亡的敏感性。（1）TRAF1结合肽可阻断tmTNF-α介导的NF-κB组成性活化:首先我们验证TRAF1结合肽能否阻断tmTNF-α活化NF-κB,将TRAF1结合肽与tmTNF-α阳性的Raji细胞共孵育24 h,用tmTNF-α抗体进行免疫共沉淀实验。与预期结果一致,TRAF1结合肽可竞争性抑制TRAF1与tmTNF-α的结合,进而抑制IKKα和NIK的募集。该结果证实TRAF1结合肽可抑制tmTNF-α反向信号复合物的形成。（2）TRAF1结合肽可提高tmTNF-α阳性白血病细胞株对阿霉素的敏感性:用15μM TRAF1结合肽预处理tmTNF-α阳性的Raji细胞和THP-1细胞2 h,再用不同浓度的阿霉素作用24 h,结果证实TRAF1结合肽可明显提高Raji细胞和THP-1细胞对阿霉素杀伤效应的敏感性。与此同时,Western blot结果证实TRAF1结合肽可有效抑制tmTNF-α诱导的p100降解成p52（非经典通路）,抑制p65的磷酸化和IκBα的降解（经典通路）。然而,TRAF1结合肽对tmTNF-α阴性的Jurkat细胞则无效应。（3）TRAF1结合肽可阻断临床白血病患者原代细胞tmTNF-α介导的NF-κB组成性活化:收集白血病临床标本9例,其中表达tmTNF-α＞20%的有4例,tmTNF-α＜12%的有5例。用TRAF1结合肽与原代白血病细胞共孵育24 h,Western blot结果显示TRAF1结合肽可有效抑制tmTNF-α阳性的原代白血病细胞p100、IκBα的降解以及p65的磷酸化,而低表达或不表达tmTNF-α的原代白血病细胞p100、IκBα的降解以及p65的磷酸化则无明显变化。提示TRAF1结合肽可特异性阻断原代白血病细胞tmTNF-α反向信号激活NF-κB经典和非经典通路。3.TRAF1结合肽在体内具有化疗促敏效应为验证TRAF1结合肽的体内促敏效应,我们将1×10~7/ml tmTNF-α阳性的Raji细胞注射至NCG小鼠皮下,构建淋巴瘤动物模型。当肿瘤达到50 mm~3后,随机分成4组（PBS组、DOX组、DOX+TRAF1对照肽组和DOX+TRAF1结合肽组）,每组6只小鼠,每周1次尾静脉给予5 mg/kg阿霉素（共给3周）,同时每天腹腔注射15 mg/kg TRAF1结合肽或对照肽。实验结果显示:与其他处理组相比,联用TRAF1结合肽和DOX可明显延长小鼠的半数致死时间。该结果提示:TRAF1结合肽在体内具有化疗促敏效应。综上所述,本研究证实TRAF1为转导tmTNF-α反向信号组成性活化NF-κB通路的关键分子。用TRAF1结合肽可竞争性抑制tmTNF-α募集完整的TRAF1,阻断tmTNF-α反向信号组成性活化NF-κB,进而提高白血病细胞对阿霉素的敏感性。本研究结果不但阐明tmTNF-α反向信号激活NF-κB通路的分子机制,还为阻断白血病细胞耐药和其精准治疗提供新的靶点与线索。