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第一部分金合欢素对大鼠CYP450酶体内外代谢活性的影响
目的：建立UPLC-MS/MS方法同时检测CYP450各酶系探针药及其代谢产物的方法，探究铜丝藤根主要成分金合欢素对大鼠CYP450酶体内外代谢活性的影响。
方法：（1）建立了大鼠肝微粒体的孵育体系,以CYP1A2、CYP2B6、CYP2D2、CYP2C11、CYP2E1、CYP3A1/2探针药（非那西汀，安非他酮，右美沙芬，甲苯磺丁脲，氯唑沙宗，咪达唑仑）为底物和金合欢素为抑制剂。经条件优化后，200μl的孵育体系中，含有5-10pmol大鼠微粒体，6种探针底物混合溶液以及10mM磷酸钾缓冲液（PH=7.4），随后加入1～100μM的金合欢素梯度溶液，在37℃水浴中预孵育5min，加入1mM的NADPH启动反应进行，孵育时间为30min。样品处理采用乙腈沉淀蛋白的方法。涡旋1分钟后13000rpm离心10min，最后取2μl上清液进样经UPLC-MS/MS检测6种探针药代谢物的生成量，并分别计算其IC50值。（2）将12只雄性健康SD大鼠随机分为2组，作为对照组和实验组，每组6只。实验组腹腔注射50mg/kg金合欢素，连续给药一周后，提前禁食12h，对照组和对照组灌胃给予10mg/kg混合剂量的6种探针药。灌胃后在0.083,0.25,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,12和24h采取血样，4000rpm离心10min后取血浆置于-80℃保存。建立UPLC-MS/MS法检测大鼠血浆中6种探针药及其代谢产物的血药浓度的方法，运用DAS3.0软件进行药物动力学分析及SPSS17.0进行统计学分析。
结果：（1）建立了简单灵敏可靠的检测大鼠血浆中6种CYP450酶系探针药及其代谢产物的UPLC-MS/MS方法。在一定的浓度范围内，血浆中所检测的样品具有良好的线性关系。方法学验证显示，日间精密度（RSD）和日内精密度（RSD）分别在在13.4%和15.64%的范围内；日间准确度（RE）和日内准确度（RE）均在115%的范围内；提取回收率在77.25至94.31%之间，说明各个样品在该方法下具有良好的提取回收率；基质效应在82.69%-95.35%之间，说明样品的检测不受基质所影响；混合样品在-4℃24h，以及反复冻融3次后仍具有良好的稳定性。（2）通过体外孵育实验，确定了六种探针底物的浓度：非那西丁，安非他酮，右美沙芬，甲苯磺丁脲，氯唑沙宗及咪达唑仑溶液的浓度分别为40μM，20μM，10μM，100μM，20μM和5μM。在1-100μM浓度范围内，药物金合欢素对6种CYP450酶系探针药表现出不同程度的抑制作用。其IC50分别为：3.627μM，4.118μM，83.93μM，4.535μM，12.46μM，5.954μM。（3）通过大鼠体内药动学实验，发现金合欢素对六种探针药均有抑制作用，实验组非那西丁的AUC(0-t)是对照组的1.58倍，AUC(0-∞)是对照组的1.6倍，清除率CLz/F与对照组相比下降了38.5%，在Cmax方面，实验组非那西丁是对照组的1.79倍；实验组安非他酮的AUC(0-t)和AUC(0-∞)均是对照组的1.72倍，MRT(0-t)和MRT(0-∞)与对照组相较，分别下降了17.5%和18.0%,而实验组的Cmax是对照组的2.58倍，清除率CLz/F则为对照组的60.2%；实验组右美沙芬AUC(0-t)和AUC(0-∞)与对照组相比较，可以发现AUC(0-t)和AUC(0-∞)增加了1.02倍，而清除率CLz/F，实验组与对照组相比下降了50%，Vz/F实验组与对照组相较，下降到48.7%，达峰浓度Cmax实验组是对照组的2.25倍，实验组甲苯磺丁脲的AUC(0-∞)是对照组的1.54倍，清除率CLz/F与对照组相比，仅为对照组的70.6%，而达峰浓度Cmax是对照组的1.43倍；实验组咪达唑仑AUC(0-t)和AUC(0-∞)均增加到对照组的2.58倍，而清除率CLz/F，实验组与对照组相比下降了63.2%，Vz/F实验组与对照组相较，下降了57.6%，Cmax更是对照组的3.04倍；实验组氯唑沙宗AUC(0-t)和AUC(0-∞)分别是对照组的2.45倍和2.44倍，Vz/F与对照组比较下降了49.3%，而达峰浓度Cmax是对照组的1.85倍。
结论：结合体内外实验，我们认为金合欢素对CYP450亚酶探针药代谢有不同程度的抑制作用，以非那西丁和安非他酮抑制作用最为严重，长期服用含金合欢素的中药存在引起肝脏损伤的风险。金合欢素在人体内的抑制作用有待进一步研究，当病人同时服用含金合欢素的中药和经CYP450酶代谢的药物时，尤其是CYP1A2和CYP2B6，应考虑给药剂量的调整。
第二部分金合欢素对地西泮在大鼠体内外代谢影响
目的：建立UPLC-MS/MS方法检测大鼠体内外样品中地西泮的浓度，研究金合欢素对地西泮在大鼠体内外代谢的影响。
方法：（1）采用ACQUITYUPLCBEHC18(50mm×2.1mm,1.7μm)色谱柱，流动相为乙腈-0.1%甲酸水进行梯度洗脱，使用正离子多离子反应监测（MRM）扫描的UPLC-MS/MS方法测定底物地西泮及其代谢产物去甲西泮和替马西泮的浓度。（2）建立了以地西泮为底物的大鼠肝微粒体体外孵育体系体系。在200μL的大鼠肝微粒孵育体系中，包含有20μL的磷酸钾缓冲液，10μL的大鼠肝微粒体，此外，加入1-100μM的地西泮梯度溶液，孵育时间为30min，样品处理后经GraphPad7.0得到地西泮代谢的米氏方程。（3）在上述溶液中加入1-100μM的金合欢素作为抑制剂，通过体外孵育，计算得到金合欢素抑制地西泮的IC50值。（4）12只雄性SD大鼠随机分为2组：实验组和对照组，每组6只。实验组大鼠腹腔注射50mg/kg的金合欢素，每天一次，连续给药2周后，灌胃给予10mg/kg的地西泮；对照组与实验组保持一致给予10mg/kg的地西泮。在灌胃后的以下这些时间点，0.083，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6和8h，通过尾静脉采取血样，离心后取血浆保存于-80℃冰箱中。通过UPLC-MS/MS法检测大鼠血浆中地西泮的血药浓度，运用DAS3.0系统进行相关的药动学分析和SPSS17.0系统进行统计学分析。
结果：（1）建立了灵敏可靠的检测血浆中地西泮及其代谢产物去甲西泮和替马西泮的UPLC-MS/MS方法。血浆中地西泮在浓度范围内均显示良好的线性(r＞0.99)。方法日内精密度（RSD）的范围为1.88%-12.36%，日间精密度在5.07%-8.67%的范围内；日间准确度及日内准确度（RE%）在99.87%-104.76%之间，说明样品在该方法的条件下具有较好的准确度及精密度；提取回收率均大于73.1%；基质效应在92%-107.6%之间，基质对检测不造成影响；样品在室温放置6h，处理后4℃放置24h及次冻融循环下，仍具有较好的稳定性。（2）在200μL的大鼠肝微粒体孵育条件下，中药单体金合欢素对地西泮有抑制作用。以50μM地西泮为底物，1-100μM的金合欢素为抑制剂，磷酸钾缓冲液及大鼠肝微粒共同构成体外孵育体系，由结果可知，金合欢素抑制地西泮代谢成去甲西泮的IC50为5.2μM，抑制其形成替马西泮的IC50值为2.065μM。（3）通过实验组大鼠与对照组大鼠相比较，发现实验组大鼠的药动学参数发生了明显改变，对于腹腔注射了2周金合欢素的实验组大鼠，地西泮的AUC（0-t）为对照组的1.7倍；AUC(0-∞)与实验组增加了69.76%；清除率CL/F与对照组相比，降低了43.4%左右；Cmax为对照组的1.9倍。
结论：结合体内外实验，我们认为金合欢素对地西泮的代谢存在抑制作用，其抑制可能跟其代谢主要经CYP3A1/2和CYP2C19有关，因此，在长期服用含金合欢素单体的中药时，需注意联合用药可能引起的不良反应。金合欢素在人体内的抑制作用有待进一步研究，当病人同时服用含金合欢素的中药和经CYP450酶代谢的药物时，尤其是CYP3A1/2和CYP2C19，应考虑给药剂量的调整，这些数据结果也为服用地西泮的患者在合理用药方面提供相关的科学依据。
目的：建立UPLC-MS/MS方法同时检测CYP450各酶系探针药及其代谢产物的方法，探究铜丝藤根主要成分金合欢素对大鼠CYP450酶体内外代谢活性的影响。
方法：（1）建立了大鼠肝微粒体的孵育体系,以CYP1A2、CYP2B6、CYP2D2、CYP2C11、CYP2E1、CYP3A1/2探针药（非那西汀，安非他酮，右美沙芬，甲苯磺丁脲，氯唑沙宗，咪达唑仑）为底物和金合欢素为抑制剂。经条件优化后，200μl的孵育体系中，含有5-10pmol大鼠微粒体，6种探针底物混合溶液以及10mM磷酸钾缓冲液（PH=7.4），随后加入1～100μM的金合欢素梯度溶液，在37℃水浴中预孵育5min，加入1mM的NADPH启动反应进行，孵育时间为30min。样品处理采用乙腈沉淀蛋白的方法。涡旋1分钟后13000rpm离心10min，最后取2μl上清液进样经UPLC-MS/MS检测6种探针药代谢物的生成量，并分别计算其IC50值。（2）将12只雄性健康SD大鼠随机分为2组，作为对照组和实验组，每组6只。实验组腹腔注射50mg/kg金合欢素，连续给药一周后，提前禁食12h，对照组和对照组灌胃给予10mg/kg混合剂量的6种探针药。灌胃后在0.083,0.25,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,12和24h采取血样，4000rpm离心10min后取血浆置于-80℃保存。建立UPLC-MS/MS法检测大鼠血浆中6种探针药及其代谢产物的血药浓度的方法，运用DAS3.0软件进行药物动力学分析及SPSS17.0进行统计学分析。
结果：（1）建立了简单灵敏可靠的检测大鼠血浆中6种CYP450酶系探针药及其代谢产物的UPLC-MS/MS方法。在一定的浓度范围内，血浆中所检测的样品具有良好的线性关系。方法学验证显示，日间精密度（RSD）和日内精密度（RSD）分别在在13.4%和15.64%的范围内；日间准确度（RE）和日内准确度（RE）均在115%的范围内；提取回收率在77.25至94.31%之间，说明各个样品在该方法下具有良好的提取回收率；基质效应在82.69%-95.35%之间，说明样品的检测不受基质所影响；混合样品在-4℃24h，以及反复冻融3次后仍具有良好的稳定性。（2）通过体外孵育实验，确定了六种探针底物的浓度：非那西丁，安非他酮，右美沙芬，甲苯磺丁脲，氯唑沙宗及咪达唑仑溶液的浓度分别为40μM，20μM，10μM，100μM，20μM和5μM。在1-100μM浓度范围内，药物金合欢素对6种CYP450酶系探针药表现出不同程度的抑制作用。其IC50分别为：3.627μM，4.118μM，83.93μM，4.535μM，12.46μM，5.954μM。（3）通过大鼠体内药动学实验，发现金合欢素对六种探针药均有抑制作用，实验组非那西丁的AUC(0-t)是对照组的1.58倍，AUC(0-∞)是对照组的1.6倍，清除率CLz/F与对照组相比下降了38.5%，在Cmax方面，实验组非那西丁是对照组的1.79倍；实验组安非他酮的AUC(0-t)和AUC(0-∞)均是对照组的1.72倍，MRT(0-t)和MRT(0-∞)与对照组相较，分别下降了17.5%和18.0%,而实验组的Cmax是对照组的2.58倍，清除率CLz/F则为对照组的60.2%；实验组右美沙芬AUC(0-t)和AUC(0-∞)与对照组相比较，可以发现AUC(0-t)和AUC(0-∞)增加了1.02倍，而清除率CLz/F，实验组与对照组相比下降了50%，Vz/F实验组与对照组相较，下降到48.7%，达峰浓度Cmax实验组是对照组的2.25倍，实验组甲苯磺丁脲的AUC(0-∞)是对照组的1.54倍，清除率CLz/F与对照组相比，仅为对照组的70.6%，而达峰浓度Cmax是对照组的1.43倍；实验组咪达唑仑AUC(0-t)和AUC(0-∞)均增加到对照组的2.58倍，而清除率CLz/F，实验组与对照组相比下降了63.2%，Vz/F实验组与对照组相较，下降了57.6%，Cmax更是对照组的3.04倍；实验组氯唑沙宗AUC(0-t)和AUC(0-∞)分别是对照组的2.45倍和2.44倍，Vz/F与对照组比较下降了49.3%，而达峰浓度Cmax是对照组的1.85倍。
结论：结合体内外实验，我们认为金合欢素对CYP450亚酶探针药代谢有不同程度的抑制作用，以非那西丁和安非他酮抑制作用最为严重，长期服用含金合欢素的中药存在引起肝脏损伤的风险。金合欢素在人体内的抑制作用有待进一步研究，当病人同时服用含金合欢素的中药和经CYP450酶代谢的药物时，尤其是CYP1A2和CYP2B6，应考虑给药剂量的调整。
第二部分金合欢素对地西泮在大鼠体内外代谢影响
目的：建立UPLC-MS/MS方法检测大鼠体内外样品中地西泮的浓度，研究金合欢素对地西泮在大鼠体内外代谢的影响。
方法：（1）采用ACQUITYUPLCBEHC18(50mm×2.1mm,1.7μm)色谱柱，流动相为乙腈-0.1%甲酸水进行梯度洗脱，使用正离子多离子反应监测（MRM）扫描的UPLC-MS/MS方法测定底物地西泮及其代谢产物去甲西泮和替马西泮的浓度。（2）建立了以地西泮为底物的大鼠肝微粒体体外孵育体系体系。在200μL的大鼠肝微粒孵育体系中，包含有20μL的磷酸钾缓冲液，10μL的大鼠肝微粒体，此外，加入1-100μM的地西泮梯度溶液，孵育时间为30min，样品处理后经GraphPad7.0得到地西泮代谢的米氏方程。（3）在上述溶液中加入1-100μM的金合欢素作为抑制剂，通过体外孵育，计算得到金合欢素抑制地西泮的IC50值。（4）12只雄性SD大鼠随机分为2组：实验组和对照组，每组6只。实验组大鼠腹腔注射50mg/kg的金合欢素，每天一次，连续给药2周后，灌胃给予10mg/kg的地西泮；对照组与实验组保持一致给予10mg/kg的地西泮。在灌胃后的以下这些时间点，0.083，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6和8h，通过尾静脉采取血样，离心后取血浆保存于-80℃冰箱中。通过UPLC-MS/MS法检测大鼠血浆中地西泮的血药浓度，运用DAS3.0系统进行相关的药动学分析和SPSS17.0系统进行统计学分析。
结果：（1）建立了灵敏可靠的检测血浆中地西泮及其代谢产物去甲西泮和替马西泮的UPLC-MS/MS方法。血浆中地西泮在浓度范围内均显示良好的线性(r＞0.99)。方法日内精密度（RSD）的范围为1.88%-12.36%，日间精密度在5.07%-8.67%的范围内；日间准确度及日内准确度（RE%）在99.87%-104.76%之间，说明样品在该方法的条件下具有较好的准确度及精密度；提取回收率均大于73.1%；基质效应在92%-107.6%之间，基质对检测不造成影响；样品在室温放置6h，处理后4℃放置24h及次冻融循环下，仍具有较好的稳定性。（2）在200μL的大鼠肝微粒体孵育条件下，中药单体金合欢素对地西泮有抑制作用。以50μM地西泮为底物，1-100μM的金合欢素为抑制剂，磷酸钾缓冲液及大鼠肝微粒共同构成体外孵育体系，由结果可知，金合欢素抑制地西泮代谢成去甲西泮的IC50为5.2μM，抑制其形成替马西泮的IC50值为2.065μM。（3）通过实验组大鼠与对照组大鼠相比较，发现实验组大鼠的药动学参数发生了明显改变，对于腹腔注射了2周金合欢素的实验组大鼠，地西泮的AUC（0-t）为对照组的1.7倍；AUC(0-∞)与实验组增加了69.76%；清除率CL/F与对照组相比，降低了43.4%左右；Cmax为对照组的1.9倍。
结论：结合体内外实验，我们认为金合欢素对地西泮的代谢存在抑制作用，其抑制可能跟其代谢主要经CYP3A1/2和CYP2C19有关，因此，在长期服用含金合欢素单体的中药时，需注意联合用药可能引起的不良反应。金合欢素在人体内的抑制作用有待进一步研究，当病人同时服用含金合欢素的中药和经CYP450酶代谢的药物时，尤其是CYP3A1/2和CYP2C19，应考虑给药剂量的调整，这些数据结果也为服用地西泮的患者在合理用药方面提供相关的科学依据。