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第一部分:IL6/STAT3通路参与CP进程中的ADM的形成【目的】通过在体和离体实验,探究STAT3信号通路在慢性胰腺炎（CP）胰腺腺泡细胞导管化生（ADM）形成过程中的变化及调控机制。【方法】1.在体实验:采用cerulein（50ug/kg,6次/天,3天/周）腹腔注射C57BL/6小鼠诱发CP模型,于造模1周后开始给予STAT3抑制剂S31-201NSC（100mg/kg,1次/天,6天/周）腹腔注射治疗。于造模及治疗后的2、4、6周分别麻醉处死动物,完整摘取小鼠胰腺组织。HE染色观察小鼠胰腺病理组织学的变化及纤维化程度;免疫荧光双标法染色标记淀粉酶与CK-19的表达变化;Western blot检测胰腺组织CK-19、IL-6R蛋白表达的变化。2.离体实验:购买266-6细胞系（小鼠胰腺腺泡细胞系）,用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。采用5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L的cerulein刺激266-6细胞,分别在1h、8h、24h、48h四个时间点收集细胞,细胞免疫荧光双标法检测Amylase和CK-19的表达;另外采用20nmol/L的cerulein或者10ng/ml的IL-6刺激266-6细胞24h、48h后收集细胞,Western blot检测CK-19、p-STAT3、STAT3蛋白的表达变化,进一步采用20nmol/L的cerulein联合10ng/ml的IL-6刺激266-6细胞,分别在1h、4h、8h、24h用免疫荧光双标法标记Amylase和CK-19的表达。【结果】1.在体实验:（1）cerulein诱发的小鼠CP模型中ADM的形成HE染色显示:造模2周后,模型组小鼠出现胰腺腺泡损伤,炎性细胞浸润和少量胶原沉积;随着病程的进展,造模4周后小鼠胰腺腺泡萎缩,逐渐被胰腺导管上皮细胞和成纤维组织替代即ADM,胰腺结构严重破坏,炎性细胞广泛浸润,胶原大量沉积;造模6周后部分胰腺形态丧失,大量纤维化形成,ADM随之减少。Amylase与CK-19的免疫荧光双标法染色显示:造模2周后Amylase的表达上升,可能与cerulein刺激腺泡细胞释放大量淀粉酶所致,此时CK-19的表达较弱,提示ADM形成较少,而造模4周后Amylase的表达明显降低,而CK-19的表达增加,说明腺泡细胞大量化生为导管细胞,造模6周后Amylase的表达进一步降低,提示小鼠胰腺外分泌功能受损加重,而CK-19的表达亦呈现低表达,可能是由于胰腺组织破坏加重、被纤维化组织取代,腺泡细胞管状化减少。（2）STAT3信号通路抑制剂对胰腺ADM的影响进一步通过Western blot检测CP小鼠胰腺组织中CK-19蛋白的表达显示:CP模型小鼠2周可见胰腺组织表达CK-19,造模后4周,CK-19表达进一步升高（p<0.05）,到6周时反而有所减轻（p<0.05）。另外,我们还发现造模2周后胰腺组织IL-6R的表达水平也明显升高（p<0.01）,且随着造模时间的延长而增加,造模后6周仍旧维持较高水平（p<0.01）。继而采用IL-6/STAT3信号通路抑制剂NSC后发现,NSC治疗后不仅各个时间点IL-6R的表达明显减少（p<0.01）,胰腺组织CK-19的表达也明显低于同一时间点的模型组（p<0.01）。2.离体实验:采用Amylase和CK-19的免疫荧光双标染色法发现:5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L的cerulein刺激胰腺腺泡细胞266-6,1h后均可观察到CK-19的表达升高,但此时Amylase的表达量仍较高。而20nmol/Lcerulein刺激24h后CK-19的表达进一步升高（p<0.01）,Western blot检测发现,cerulein刺激266-6细胞48h后CK-19的表达略有降低但仍高于空白对照组（p<0.01）。细胞在各个浓度cerulein刺激24h后均呈现CK-19的峰值表达（p<0.01）。同时检测腺泡细胞p-STAT3的表达变化,发现p-STAT3的表达趋势与CK-19一致（p<0.01）,提示腺泡细胞形成ADM形成与STAT3通路的激活有关。继而采用10ng/ml的IL-6刺激266-6细胞,检测发现:IL-6也可以引发266-6细胞表达CK-19,只是时间晚于cerulein刺激组,刺激24h后CK-19的表达明显升高（p<0.01）。Western blot结果也显示CK-19表达增多,同时IL-6也可导致pSTAT3表达升高。提示胰腺腺泡细胞ADM的形成与p-STAT3通路有密切关系。20nmol/L cerulein联合10ng/ml IL-6刺激266-6细胞后,用免疫荧光双标法检测发现CK-19的表达更为明显。【结论】1.ADM是cerulein诱发的小鼠CP模型中重要的早期病理表现,而ADM的形成可能与IL6/STAT3信号通路有关,抑制STAT3信号通路可以减少ADM的形成。2.ADM的形成来源于腺泡细胞,高浓度cerulein能够诱导离体的腺泡细胞发生ADM,表明过度刺激是导致胰腺腺泡细胞管状化的重要诱因。3.IL-6刺激可以导致胰腺腺泡细胞ADM形成,提示炎症环境是诱发ADM形成的重要原因,IL6/STAT3信号通路在ADM形成中发挥调控作用。第二部分:黄芩苷通过抑制胰腺腺泡细胞ADM的形成减轻CP胰腺纤维化【目的】探究黄芩苷对小鼠CP模型胰腺组织及266-6胰腺腺泡细胞ADM形成及胰腺纤维化的影响及相关机制。【方法】1.在体部分:采用cerulein腹腔注射C57BL/6小鼠诱发CP模型（同第一部分）,于造模1周后开始给予黄芩苷（50mg/kg,1次/天,6天/周）腹腔注射治疗。在造模及治疗后的2、4、6周取材,完整摘取小鼠胰腺组织,Masson染色观察胰腺纤维化的变化,免疫组化染色法观察纤维化指标FN及ADM指标CK-19的变化;Western blot检测CK-19、p-STAT3、STAT3的表达变化。2.离体部分:采用20nmol/L的cerulein刺激266-6细胞,并给予75ug/ml和50ug/ml的黄芩苷干预,于24、48小时两个时间点收集细胞,Western blot检测CK-19、pSTAT3、STAT3蛋白的表达变化。【结果】1、在体部分:Masson染色显示:模型组2周时胰腺开始少量胰腺腺泡呈现管状化结构及少量胶原纤维沉积,至造模4周胰腺正常结构明显减少,被大量导管状结构和纤维化组织所取代,到造模6周胰腺结构破坏严重,主要呈现为大量纤维化组织。而黄芩苷治疗组与同一时间点模型组相比较,完整的胰腺结构明显增多,蓝染的胶原纤维明显减少。免疫组化染色法检测胰腺组织ADM的标志物CK-19的表达发现:造模2周和4周胰腺CK-19的表达逐渐增加,直到造模6周大量胰腺腺泡被纤维组织取代,CK-19表达也随之减少。免疫组化染色法检测纤维化的标志物FN的表达发现:空白对照组胰腺组织结构完整,无FN的表达,造模2周时FN表达呈现阳性,且随造模时间延长FN表达逐渐增多。Western blot检测胰腺组织CK-19的表达也呈现同样的趋势。而黄芩苷治疗组胰腺CK-19和FN的表达也明显低于同一时间点模型组（p<0.01）。Western blot检测胰腺组织中STAT3及p-STAT3的表达发现,造模2周后,p-STAT3的蛋白表达开始升高（p<0.01）,4周和6周表达进一步升高（p<0.01）;而黄芩苷治疗组与相应时间点模型组相比,p-STAT3的蛋白表达明显低于模型组（p<0.01）。2、离体部分:采用20nmol/L cerulein刺激266-6细胞24h和48h,Western blot检测CK-19、STAT3及p-STAT3的表达变化发现:刺激24h和48h,胰腺腺泡细胞CK-19、STAT3及p-STAT3表达明显高于空白对照组（p<0.01）,经不同浓度baicalin治疗后,CK-19、STAT3及p-STAT3的表达均明显下降。【结论】1.黄芩苷能通过抑制STAT3通路的激活来能减少CP进程中ADM的形成,进而减轻小鼠CP模型的纤维化程度。2.黄芩苷也可通过抑制IL-6/STAT3通路活化,减轻cerulein所诱发的胰腺腺泡细胞ADM化生。