目的:糖尿病心肌病是糖尿病患者的主要心血管并发症之一。脂质代谢紊乱是糖尿病心肌病变的一个重要影响因素。脂质积聚既是糖尿病脂代谢紊乱的结果,又是各种并发症出现的一个原发病因。那么造成脂质代谢失衡的原因是什么?脂肪酸的来源和去路出现了哪些改变才引起脂质积聚的呢?本实验从脂肪酸的两个主要代谢途径着手,观察是否是由于去路受阻引起脂质积聚。探明了脂质积聚的原因,对糖尿病心肌病脂代谢紊乱的认识及对糖尿病心肌病的防治具有重要的理论和实践意义。正常心肌从血浆中摄取进入细胞内的脂肪酸主要有两个代谢途径:一个是在限速酶二酰基甘油酰基转移酶1（diacylglycerol transferase 1,DGAT1）的催化下酯化生成甘油三酯储存在细胞内部,需要时再由脂肪酶水解,采用的是甘油二酯合成途径。2型糖尿病状态下心肌细胞内的脂肪沉积是否与心肌DGAT1的表达变化有关,未见报道。另一个就是转运到相应位点或区域进行氧化代谢,这些位点包括线粒体和过氧化物酶体等细胞器。脂肪酸在线粒体和过氧化物酶体中经β氧化途径进行氧化,肌型-肉毒碱脂酰转移酶1（muscle-carnitine palmitoyltransferase 1,M-CPT1）、脂酰辅酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase,ACOX）分别是两途径的限速酶。在心肌细胞过氧化物酶体中,参与脂肪酸氧化的ACOX有ACOX1、ACOX3两种亚型,ACOX1主要参与直链脂肪酸氧化,ACOX3主要参与2-甲基支链脂肪酸氧化。过氧化物酶体增殖物激活受体α（ peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα）在心脏脂肪酸氧化的调节中起关键作用。2型糖尿病状态下这些基因的表达有哪些变化呢?基于上述目的,本实验采用高脂饮食诱导出胰岛素抵抗再复加小剂量腹腔注射STZ的方法,成功诱导出2型糖尿病大鼠模型。在此基础上,观察心肌细胞中ACOX1、ACOX3、M-CPT1等涉及脂肪酸氧化的基因的表达情况;观察甘油三酯合成限速酶基因DGAT1,脂肪酸代谢调节基因PPARα的表达情况;同时,测定脂肪酸总的β氧化活性变化,测定心肌组织中甘油三酯及脂肪酸含量的变化。方法:1实验动物分组及标本处理本实验大鼠共分三组,对照组、单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组。具体方法为:8周龄雄性SD大鼠40只,体重220-250克,适应性喂养一周后,随机分为对照组15只和高脂组25只。对照组喂养标准饲料,热量组成为碳水化合物占65.5%,脂肪占10.3%,蛋白质占24.2%。高脂组喂养高脂饲料,其中脂肪主要为猪油,热量组成为碳水化合物占20.1%,脂肪占59.8%,蛋白质占20.1%。8周后,通过口服糖耐量试验（oral glucose tolerance test,OGTT）、胰岛素敏感指数（insulin sensibility index,ISI）、血糖钳技术证实高脂组大鼠产生了胰岛素抵抗;此时从高脂组中随机抽取10只大鼠作为单纯胰岛素抵抗组,其余11只大鼠禁食12h后,一次性注射小剂量2%STZ（STZ临用前用0.1M,PH4.5柠檬酸钠缓冲液配置）27mg/kg;注射72h后尾静脉采血,测定禁食6h后的空腹血糖,血糖值>7.8mmol/L的大鼠纳入糖尿病组继续用高脂饲料喂养6周。对照组和单纯胰岛素抵抗组大鼠腹腔注射等量柠檬酸钠缓冲液。实验动物处死前禁食12h,次日60mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,颈动脉插管采血,3000rpm分离血清,用于检测血液生化指标（血糖,甘油三酯等）和血中游离脂肪酸的含量;打开胸腔,迅速取出心脏,剪去血管和心脏周围结缔组织,用4℃预冷生理盐水冲洗,滤纸吸干,取5×5×5mm³左室心肌组织,固定于4%多聚甲醛溶液中,用于光镜检测;其余组织立即置于液氮中,分装后-80℃冻存,用于测定心肌组织中游离脂肪酸的含量,检测心肌组织脂肪沉积,心肌组织脂肪酸β-氧化活性,以及提取总RNA。2胰岛素敏感性测定采用血糖钳和ISI判定。3血中葡萄糖、甘油三酯和胰岛素的测定葡萄糖、甘油三酯用氧化酶法测定;胰岛素用放射免疫法测定。4心肌组织HE染色取部分左心室组织,固定于4%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋、切片、HE染色,光镜观察心肌细胞形态学改变。5心肌组织油红染色心肌组织冰冻切片（厚度8μm）快速放入4%甲醛中固定10 min,取出切片用蒸馏水冲洗干净,拭干后滴上油红稀释染液放入37℃湿盒保温,每隔3分钟补加一次染液,重复4-6次。取出切片用60%异丙醇分化至基质清晰（约10 s）,自来水充分冲洗后再投入苏木精染色液中染核40 s,最后用1%盐酸分化10 s,水充分冲洗后甘油明胶封片,镜下观察。6基因mRNA表达的测定用Trizol法提取心肌组织总RNA。以β-ACTIN作为内参照,RT-PCR法测定心肌DGAT1、ACOX1、ACOX3、M-CPT1、PPARαmRNA的相对表达量。7心肌组织甘油三酯和脂肪酸的测定甘油三酯用氧化酶法测定,脂肪酸用铜显色法测定。8心肌脂肪酸总的β氧化活性测定采用分光光度法,通过软脂酰CoA氧化引起NAD+的还原来测定脂肪酸β-氧化。每分钟还原1μmol NAD+所需的酶量为1个活性单位。样品的酶活性以每毫克样品蛋白所含的酶活性单位数表示（U/mg prot）。9心肌组织过氧化氢酶活性测定采用分光光度法,以每分钟催化1μmmol H₂O₂减少所需的酶量作为一个酶活性单位（U）,样品的酶活性以每mg样品蛋白所含的酶活性单位数（U/mg prot）表示。10数据处理所有数据均用x|_±s表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学处理分析,组间比较用单因素方差分析检验,检验以P<0.05为差异有显著性意义。结果:1造模1.1 OGTT试验高脂组各个时间点血糖值均高于对照组,差异均有统计学意义（P<0.01）。1.2血中成分及ISI高脂组大鼠体重和空腹血糖高于对照组（P<0.05）,血中甘油三酯和胰岛素的浓度比对照组增高（P<0.01）。两组的ISI差异有统计学意义（P<0.01）。1.3血糖钳结果高脂组GIR较对照组减低（P<0.01）,表明高脂组大鼠出现明显的胰岛素抵抗。1.4大鼠的血糖和血胰岛素变化STZ腹腔注射后3天,检测糖尿病组大鼠空腹血糖值均符合2型糖尿病标准,平均值为14.49±3.67mmol/L,对照组为5.25±0.43 mmol/L,差异有统计学意义（P <0.01）。胰岛素平均值为19.18±3.47μIU/ml,与对照组18. 93±4.41μIU/ml相比差异无统计学意义（P >0.05）。2组织病理学2.1心肌组织HE染色对照组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,呈椭圆形,胞浆染色均匀;单纯胰岛素抵抗组细胞排列尚整齐,未见异常;糖尿病组心肌细胞排列紊乱,胞浆自溶,肌丝断裂,脂质空泡明显。2.2心肌组织油红染色对照组心肌组织未发现脂肪滴的存在;单纯胰岛素抵抗组也未见明显异常;糖尿病组出现大量弥漫性脂肪小滴。3心肌组织各目的基因mRNA的相对表达量的变化3.1 ACOX1 mRNA的相对表达量对照组为0.5498±0.07123,单纯胰岛素抵抗组为0.6652±0.06484,糖尿病组为0.7417±0.14342。糖尿病组是对照组的1.4倍。3.2 M-CPT1 mRNA的相对表达量对照组为0.3730±0.09561,单纯胰岛素抵抗组为0.5288±0.05377,糖尿病组为0.5337±0.04740.糖尿病组是正常对照组的1.4倍。3.3 DGAT1 mRNA的相对表达量对照组为0.3891±0.06180,单纯胰岛素抵抗组为0.5494±0.04182,糖尿病组为0.8515±0.0878。糖尿病组是正常对照组的2.2倍。3.4 PPARαmRNA的相对表达量对照组为0.7065±0.09407,单纯胰岛素抵抗组为0.8444±0.03091,糖尿病组为0.6635±0.13149。PPARα的表达随病程的延长先是增加,然后又有回落趋势。3.5 ACOX3 mRNA的相对表达量对照组为0.1380±0.03745,单纯胰岛素抵抗组为0.1811±0.01538,糖尿病组为0.2058±0.01704.糖尿病组是对照组的1.5倍。4酶活测定4.1心肌组织总的脂肪酸β氧化活性测定（U/mg prot）对照组为0.001712±0.000334,单纯胰岛素抵抗组为0.002492±0.000796,糖尿病组为0.003016±0.000714。糖尿病组是对照组的1.8倍。4.2心肌组织过氧化氢酶活性测定（U/mg prot）对照组为32.11361±2.715636,单纯胰岛素抵抗组为10.64068±2.483603,糖尿病组为11.83867±2.54193。随着病情发展,心肌组织过氧化氢酶活性是逐渐下降的。5心肌组织甘油三酯含量测定（nmol/mg组织）对照组为3.7474±1.6784,单纯胰岛素抵抗组为8.3811±3.4601,糖尿病组为18.1837±11.1713。随着病情发展,心肌组织甘油三酯含量增加,脂质积聚明显,糖尿病组是对照组的4.9倍。6心肌组织总脂肪酸含量测定（μmol/g prot）对照组为158.0271±54.68046,单纯胰岛素抵抗组为186.5958±56.95322,糖尿病组为124.8384±56.07559。随着病情发展,心肌组织总脂肪酸含量未见变化。结论:1 2型糖尿病时,心肌脂肪酸氧化的增强不仅与线粒体脂肪酸氧化增强有关,还与ACOX1、ACOX3表达增加导致的过氧化物酶体脂肪酸氧化增强有关。2 2型糖尿病时,心肌组织甘油三酯积聚与甘油二酯合成途径的限速酶DGAT1的表达增加有关。