目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma MM)以骨痛、溶骨性病变、病理性骨折和贫血为临床特征,是一种浆细胞恶性克隆性增生性疾病,尽管目前多发性骨髓瘤治疗方法多种多样,包括化疗、免疫治疗及自体造血干细胞移植(autologousstem cell transpantation ASCT)等,但是至今仍不能彻底治愈,绝大多数患者都会因为复发、耐药等导致死亡,患者的中位生存期一般为3-5年。目前,通过临床治疗控制疾病进展、改善患者生活质量,延长无病生存期是多发性骨髓瘤患者最理想状态,临床上对初诊的多发性骨髓瘤患者的治疗普遍采用如M2、MP(美法仑+泼尼松)、VAD(长春新碱+阿霉素+地塞米松)等方案,但这几种方案都没有彻底治愈患者。近年来,随着各种改良方案的不断出现,MM的联合化疗有了新的进展,通过对多发性骨髓瘤发病机制及耐药机制等多方面的深入研究,新型药物免疫抑制剂、蛋白酶体抑制剂等及单克隆抗体治疗MM已经在临床上取得了较大成效,使治疗的有效率、临床缓解率、无病生存率均有明显提高。但是所有患者会复发、耐药仍是一大难题,需支付巨额医疗费用也是很多患者及家庭放弃最好治疗的一方面原因,因此新型药物的不断开发固然势在必行,而联合化疗方案的探求也值得关注。三氧化二砷(ATO)不仅在体外对多种实体瘤和血液肿瘤细胞有明显抑制增殖和诱导凋亡的作用,在临床上亦是得到广泛应用,其抗肿瘤作用得以充分发挥,尤其对恶性血液系统疾病的治疗贡献极大,有学者对ATO作用于人骨髓瘤细胞的机制进行了研究,其结果表明:ATO对RPMI8226细胞的抑制增殖及诱导凋亡作用显著;ATO将RPMI8226细胞阻滞在G1期;ATO作用后,对ERK1/2及其磷酸化蛋白表达无明显影响,使细胞的VEGF表达及分泌量减少,Bcl-2蛋白表达下降。三氧化二砷能通过多重作用机制达到抗肿瘤的目的,如诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化、抑制端粒酶活性等,因此也成为联合化疗用药的选择之一。紫杉醇也是临床常用化疗药物,其主要抗肿瘤作用机制为抑制有丝分裂过程,使细胞周期停滞在G2/M期,从而达到抑制肿瘤细胞增殖作用。该药在肺癌、食管癌、卵巢癌等实体瘤中得到广泛应用,其不良反应主要包括过敏反应、骨髓抑制、心脏毒性、神经毒性反应、癫痫发作等,严重者临床表现可危及生命,已引起了临床工作者重视,因此安全而有效的利用紫杉醇抗肿瘤也是学者们不断追求的目标。应用紫杉醇对血液系统恶性肿瘤细胞和临床试验的研究均有明确的结论,证实其在恶性血液系统疾病中也具有明显的诱导凋亡的作用。方法:不同浓度的三氧化二砷、紫杉醇及二者联合处理人骨髓瘤细胞RPMI8226细胞株,实验通过不同浓度的单药紫杉醇(药物浓度为0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5μmol/L)作用于RPMI8226细胞,本实验分为实验组和对照组(A组),实验组分为三氧化二砷单药组(药物浓度为1、2、4μmol/L)为B、C、D组,紫杉醇单药组(药物浓度为0.01μmol/L)为E组,二者联合用药组(药物浓度为ATO 1μmol/L+PTX0.01μmol/L、2μmol/L+PTX0.01μmol/L、4mol/L+PTX0.01μmol/L)为F、G、H组,运用倒置相差显微镜来观察细胞凋亡及形态学变化;在不同的时间(24h、48h、72h)通过MTT比色法检测RPMI8226细胞增殖抑制率和细胞生长率;应用流式细胞术检测对照组和实验组对细胞周期的影响;采用Western blot检测对细胞周期相关蛋白cdc2、Cyclin D1的影响。结果:1 RPMI8226细胞形态的观察倒置相差显微镜:实验中随着紫杉醇作用时间的延长,多数RPMI8226细胞出现明显变形,成杆状或梭形,细胞折光性逐渐变差,最后细胞膜变的不完整,形成较多细胞碎片。实验中三氧化二砷单药组作用过的RPMI8226细胞随浓度增加、作用时间延长,出现细胞皱缩变小,核固缩,呈均匀的致密物,细胞膜不规则突起,细胞折光性差,直至细胞膜不完整,形成细胞碎片。联合用药组比相同浓度的单药组凋亡及坏死细胞增多,细胞形态的改变与紫杉醇单药组相似。2 MTT比色法测定RPMI8226细胞增殖抑制率2.1三氧化二砷组:相同作用时间下,随着ATO药物浓度的增加,对细胞增殖抑制率呈剂量依赖性增加;相同浓度的ATO随作用时间延长,对RPMI8226细胞增殖抑制率增加,呈时间依赖性。其中,相同作用时间组中,各浓度之间均存在差异,有统计学意义(P<0.05),相同。2.2紫杉醇组:实验中,相同作用时间,PTX浓度在0.01μmol/L-1μmol/L之间,细胞增殖抑制率恒定,无明显剂量依赖,浓度在1μmol/L-3.5μmol/L之间,细胞增殖抑制率随浓度的增加而升高;同一浓度的PTX,随作用时间的延长,细胞增殖抑制率升高。浓度为0.01μmol/L的紫杉醇24h、48h、72h的抑制率分别为20.09±9.11%、39.77±1.85%、54.39±3.75%。2.3联合用药组:不同浓度的ATO与同一浓度的PTX肽联合,随ATO浓度增加,细胞生长率下降;以4μmol/L的ATO联合0.01μmol/L的PTX作用于RPMI8226细胞48小时为例,其增殖抑制率为47.95±7.32%,而4μmol/L的ATO单独作用于RPMI8226细胞48小时的增殖抑制率为32.98±6.07%,PTX0.01μmol/L单独作用于RPMI8226细胞48小时的增殖抑制率为39.77±1.85%(P<0.05),有统计学意义。二者联合对RPMI8226细胞的增殖抑制作用明显,具有浓度、时间依赖性。3流式细胞术检测细胞周期(PI染色):单药及联合用药处理RPMI8226细胞,随着药物浓度的增加,存活细胞量明显减少,凋亡细胞数量增加。细胞周期检测结果显示对照组处于G0/G1期、S期细胞分别是27.45%、68.50%,而H组处于G2期、S期细胞分别是89.37%、8.48%,实验组和对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。4 Western blot检测结果显示对照组和实验组之间cdc2蛋白表达量有统计学意义(P<0.05),与对照组比较,实验组Cyclin D1蛋白表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1三氧化二砷与紫杉醇均可诱导人骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡,抑制该细胞的增殖。2两者联合作用能显著提高RPMI8226细胞的凋亡率,增强抑制其生长的作用。3三氧化二砷、紫杉醇及二者联合使人骨髓瘤细胞RPMI8226发生细胞周期阻滞,其可能是抑制恶性肿瘤细胞增殖的有效途径之一。