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食用菌多糖是一种重要的有机生物大分子,毒副作用低,易被人和动物机体吸收利用,具有显著的抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、免疫调节、降血糖、降血脂等多种生理功能。作为味道鲜美、深受人们喜爱的秀珍菇食用菌,其多糖具有一定的抗氧化、抗肿瘤等生物活性,但与灵芝、虫草等其它真菌多糖相比,秀珍菇多糖的研究还不够深入,其多糖硒复合物的研究尚未见文献报道。因此,本文拟对秀珍菇硒菌丝体多糖进行研究。秀珍菇硒菌丝体是其多糖硒复合物制备的主要原料,为此,有必要开展富硒发酵培养基的优化。并以此硒菌丝体为材料,采用超声辅助纤维素酶法提取秀珍菇多糖,经过分离纯化,筛选得到一种高抗氧化性的复合多糖SPMP-2a,借助仪器分析等手段对SPMP-2a进行性质测定,并通过体内外试验,对其抗氧化活性进行较为全面系统的研究。研究结果如下:1、以菌丝的生长速度为指标,筛选秀珍菇菌株富硒培养的最适硒浓度为20 μg/mL;在此硒浓度下,以菌丝产量为指标,采用单因素试验筛选最佳碳源、氮源的种类及其浓度、KH2PO4的浓度;在单因素试验的基础上,通过Box-Behnken设计及响应面法分析,确定秀珍菇富硒培养的液体培养基为:亚硒酸钠0.002%、葡萄糖4.06%,黄豆粉 1.51%,KH2PO4 0.3%、MgSO4·7H2O0.15%,在25℃,160rpm条件下摇床发酵7d,菌丝产量为1.9862 g/100mL,菌丝的硒含量为385.5 μg/g。2、以秀珍菇硒菌丝体为材料,采用超声波辅助纤维素酶技术对秀珍菇多糖的提取进行研究。在单因素试验的基础上,进行正交试验优化得到秀珍菇多糖的最佳提取条件为:酶添加量为2.0%,料液比为1:50,超声时间50 min,超声功率为220 w。在此条件下,秀珍菇多糖的提取率为19.77%,多糖中的硒含量为6.550μg/mg。3、秀珍菇多糖经Sevag法脱蛋白、活性炭脱色素后,通过乙醇分级沉淀,得到40%乙醇沉淀的多糖SPMP-1、70%乙醇沉淀的多糖SPMP-2、85%乙醇沉淀的多糖SPMP-3三种多糖,以体外总抗氧化能力为指标,筛选得到抗氧化能力强的SPMP-2。采用截留分子量5 kDa和50 kDa的超滤膜对SPMP-2进行进一步分离,得到SPMP-2a、SPMP-2b、SPMP-2c三种多糖,同样以体外总抗氧化能力为指标,筛选得到抗氧化能力最强的SPMP-2a。通过IR、UV、HPLC、比色等方法对SPMP-2a进行分析,确定了 SPMP-2a是一种硒糖蛋白,其相对分子质量为3.18×104Da;多糖含量为75.68%;蛋白含量18.95%;糖醛酸含量为21.64%;硒含量为0.688%。其单糖组成为 Man:Rha:Glc:Xyl:Ara= 1.87:1.00:17.86:3.28:3.12;含有 17 种氨基酸;其糖链与蛋白肽链之间是以O-糖肽键相连;并且是一种含有α-D吡喃糖苷键的酸性硒复合多糖,存在三股螺旋。4、通过化学试验方法考察了秀珍菇复合多糖SPMP-2a的体外抗氧化活性。研究表明,SPMP-2a具有一定的清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力,其清除能力随多糖浓度的增加而不断增强,并呈一定的量效关系;同时SPMP-2a还具有一定的还原能力和对金属离子的螯合能力,也呈一定的量效关系。因此,SPMP-2a具有一定的体外抗氧化活性。5、经Hoechst 33342特异性染色,H2O2作用HaCaT细胞,其细胞核出现致密浓染强光,凋亡细胞多;流式细胞术显示,SPMP-2a各浓度组细胞凋亡率较H2O2模型组显著下降,细胞形态逐步恢复,细胞凋亡率下降。Western blot显示,H2O2模型组HaCaT细胞Bcl-2蛋白表达量下降,经SPMP-2a处理后,Bcl-2蛋白表达量上升,与SPMP-2a引起的细胞凋亡率下降有很好的一致性,这表明SPMP-2a能够通过促进Bcl-2基因的表达而调控H2O2引起的HaCaT细胞凋亡。SPMP-2a预处理能够提高受损HaCaT细胞内的SOD、CAT酶活性,减少ROS含量,避免细胞氧化应激损伤,显著提高受损细胞的存活率。因此,SPMP-2a通过促进HaCaT细胞SOD和CAT等抗氧化酶活性,降低细胞内ROS含量,减轻对抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制作用,从而抑制细胞凋亡过程的发生。随着SPMP-2a浓度的增加,其对氧化损伤的保护作用愈显著,这表明SPMP-2a可以抑制H2O2诱导的HaCaT细胞凋亡,提高细胞的抗氧化能力。6、采用腹腔注射D-Gal建立小鼠衰老模型,同时灌胃不同剂量的SPMP-2a,通过测定小鼠肝、脑组织中CAT、SOD、GSH-Px的活性和MDA的含量以及小鼠血清AST、ALP、ALT等指标,SPMP-2a能够显著提高D-Gal致衰老小鼠的肝脏指数和脾脏指数,增强肝、脑组织中的SOD、GSH-Px及CAT活力,降低肝、脑组织中的MDA含量,表明SPMP-2a可显著抑制D-Gal致衰老小鼠机体组织器官的退化,提高抗氧化酶活性,增强清除羟基自由基及超氧阴离子自由基等活性氧的能力。因此,SPMP-2a具有延缓衰老作用。