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皮肤癌是全球常见癌症之一,美国2010年皮肤癌的确诊人数超过200万。皮肤癌在中国的发病率较低,但由于臭氧层的破坏等环境因素的影响,皮肤癌在我国的发病率逐年上升。目前我国公共卫生系统尚未建立有效预防皮肤癌的体系,中国未来将面临巨大的健康挑战。治疗皮肤癌的方案有手术治疗、放疗、化疗及靶向药物等。靶向MAPK家族的BRAF和MEK抑制剂是晚期皮肤癌的重要靶向药物,但是由此而生的耐药问题使得开发新的靶点及靶向药物越发急切。TOPK为MAPKK家族的激酶,能够诱导皮肤癌的发生发展,为新兴的抗癌靶点。3-去氧苏木查尔酮(3-DSC)是中国药用植物苏木的提取物,我们的前期研究发现该化合物靶向TOPK抑制结肠癌的发生发展,但该化合物在皮肤癌中作用尚不明确。本文主要研究3-DSC预防紫外线造成的皮肤损伤及抑制皮肤癌的作用机制,为皮肤癌的靶向药物研发提供新的思路。给予3-DSC处理组和对照组SKH1无毛小鼠急性紫外线照射,小鼠背部局部皮肤经3-DSC处理后可预防紫外照射引起的皮肤增厚,降低p-TOPK及其相关信号通路蛋白的表达量。3-DSC 可以抑制皮肤癌细胞(SK-MEL-2、SK-MEL-28、A375 和 A431)的增殖,并通过调控细胞周期,诱导细胞周期阻滞在G2/M期。同时在蛋白印迹实验中G2/M期相关蛋白质cyclinB1的表达量下调,在蛋白水平印证了 G2/M期阻滞。3-DSC可以诱导皮肤癌细胞的凋亡并上调凋亡标志蛋白质cleaved caspase-3和cleaved caspase-7的表达量。3-DSC可通过下调TOPK信号转导通路蛋白质磷酸化水平进而抑制皮肤癌细胞生长增殖及SK-MEL-2细胞异种移植瘤(cell derived xenograft,CDX)的进展。因此,本文阐明了苏木提取物3-DSC可通过抑制TOPK激酶活性,进而在体内外水平抑制皮肤癌的发生发展。该研究将为3-DSC以及其他TOPK抑制剂在皮肤癌的临床预防及治疗提供理论依据。方法1.激酶实验:用MBP底物检测2.5、5、10、20μM梯度的3-DSC对TOPK激酶活性的影响及其降低激酶活性的浓度。2.蛋白下拉实验:根据计算机模拟结合实验预测的TOPK与3-DSC之间的结合位点,构建TOPK突变质粒,并在293T细胞中过表达,收集细胞裂解液,用细胞裂解液分别和亲和配体珠子及3-DSC-亲和配体珠子孵育并洗脱,利用其物理结构结合,验证3-DSC与TOPK的结合位点。3.蛋白印迹实验:检测皮肤及其癌细胞系的TOPK表达量4.细胞毒性和生长增殖实验:利用酶标仪结合噻唑蓝以及二甲基亚砜试剂检测不同浓度梯度3-DSC处理皮肤正常细胞或皮肤癌细胞后,570 nm的吸光度值,检测3-DSC对正常皮肤细胞的毒性以及对皮肤癌细胞的增殖抑制作用。5.软琼脂集落形成实验:检测3-DSC对皮肤癌细胞系克隆形成的抑制作用。6.细胞周期实验:利用碘化丙啶(PI)染料对细胞DNA的染色并使用流式细胞仪检测细胞在G1期(1N)、S期(1N-2N)、G2/M期(2N)的分布情况,从而探究3-DSC对皮肤癌细胞生长周期的调控作用。7.细胞凋亡实验:利用Annexin V与细胞膜内侧含负电磷脂的特异性结合符合早期凋亡特性,及PI染料对活细胞不透膜的特性,并利用细胞流式仪,检测3-DSC对皮肤癌细胞凋亡的影响及活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞的比例。8.TOPK敲低实验:用shRNA的方法转染质粒收集shTOPK的病毒,并感染选定高表达皮肤癌细胞系,经嘌呤霉素筛选获得敲低TOPK的皮肤癌细胞,利用细胞增值实验及软琼脂集落形成实验检测TOPK敲低组细胞与对照组相比对3-DSC的敏感性差异。9.对细胞信号转导通路TOPK/ERK/RSK/c-Jun的检测:对皮肤癌细胞系(SK-MEL-2、SK-MEL-28、A375和A431)应用 3-DSC(0、5、10、20μM)后,用蛋白印迹实验探究不同浓度的3-DSC对TOPK磷酸化及其下游信号通路的影响10.急性紫外线照射实验:模拟太阳紫外线照射,检测3-DSC对紫外线处理后的小鼠皮肤厚度及TOPK信号转导通路蛋白表达水平的影响。11.小鼠体内细胞异种移植(CDX)模型实验:通过对构建的皮肤癌细胞系SK-MEL-2细胞异种移植小鼠模型腹腔注射3-DSC,检测其在小鼠体内对皮肤癌生长的抑制情况。结果1.激酶实验中3-DSC(2.5-20 μM)可以抑制TOPK激酶底物的磷酸化,表明3-DSC可抑制TOPK激酶的磷酸化。2.下拉实验中,3-DSC可以与未突变TOPK结合,表明3-DSC可以靶向TOPK。3-DSC与Thr42和Asn172位点突变TOPK几乎不结合,表明3-DSC与TOPK激酶的结合位点为Thr42和Asn172。3.蛋白印迹实验中,SK-MEL-2和A375细胞系的TOPK蛋白表达量与SK-MEL-28和A431相比,SK-MEL-2和A375细胞系的TOPK蛋白表达量更高。4.MTT实验中浓度为0、5、10、20μM的3-DSC对正常人类皮肤纤维细胞(NHDF)无毒性作用。10 μM、20 μM的3-DSC在48 h、72 h和96 h时抑制皮肤癌细胞系生长增殖(p<0.01)。5.软琼脂克隆实验中3-DSC在10 μM、20 μM浓度时可抑制皮肤癌细胞(SK-MEL-2、SK-MEL-28、A375 和 A431)软琼脂克隆形成。6.细胞周期实验中3-DSC在20 μM浓度时可将皮肤癌细胞(SK-MEL-2、A375和A431)周期阻滞于G2/M期。7.凋亡实验中10 μM、20 μM的3-DSC诱导皮肤癌细胞(SK-MEL-2、A375和A431)凋亡。8.细胞敲低实验中,在TOPK高表达的皮肤癌细胞系(SK-MEL-2和A375)中敲低TOPK,细胞增殖受到抑制,软琼脂克隆数目减少,3-DSC对下调TOPK细胞系的增殖抑制作用降低。9.蛋白印迹实验中,3-DSC能够抑制TOPK/ERK/RSK/c-Jun信号通路的磷酸化水平,3-DSC在10 μM即可发挥作用,且其抑制作用呈药物浓度依赖性。10.急性紫外线照射实验中,浓度为500 nmole、1000 nmole的3-DSC可通过抑制TOPK信号转导通路,降低急性紫外线暴露引起的皮肤增厚。11.CDX实验中,10 mg/kg和20 mg/kg浓度的3-DSC通过抑制TOPK蛋白信号转导通路的磷酸化,抑制SK-MEL-2细胞CDX模型肿瘤生长。且3-DSC(10和20 mg/kg)在治疗期间对小鼠肝脾重量及体重无显著影响。结论1.3-DSC通过与TOPK的Thr42和Asn172位点结合,抑制TOPK的激酶活性。2.3-DSC通过靶向TOPK抑制皮肤癌细胞的增殖,软琼脂克隆的形成,诱导细胞周期阻滞于G2/M期和细胞凋亡。3.3-DSC可以通过抑制TOPK信号通路的磷酸化水平,降低皮肤厚度,预防紫外线对小鼠皮肤造成的急性损伤。4.3-DSC可以通过介导TOPK信号通路,抑制小鼠人源皮肤癌细胞异种移植瘤(CDX)的生长。