研究背景及目的:以中医理论为指导,脂代谢失调是人体气机失调引起,气津失调则成痰湿,气血失调则致血瘀。辛能行滞散结,苦能燥湿降浊,辛苦味和化,则使气的升降出入条达,实现人体代谢平衡。然而,表达辛苦味功效的活性物质基础并不明确,能反映辛苦味药性特点的作用机制仍有待阐明。为了探讨中药调节脂代谢的活性物质基础和生物作用机制,本文收集了 376个单体构建中药化合物库,分别从细胞表型和生物通路两个层次研究调节脂代谢的活性物质基础,从该应用研究中探讨辛苦味中药的作用规律。研究方法:一、细胞表型层次:采用三种脂堆积细胞表型发现调节脂代谢活性成分（1）采用3T3-L1脂肪细胞诱导脂滴堆积模型,以Nile red和Bodipy 493/503标记细胞脂滴,以10 μM为初筛浓度,化合物连续作用于分化的脂肪细胞6 d,以筛选具有抑制脂滴堆积的活性成分。然后,采用免疫荧光方法标记脂滴生物标志物,验证活性成分抑制脂滴堆积作用并分析其分子机制。具体包括沉默调节蛋白1（SIRT1）、过氧化物酶增殖体激活受体γ（PPARγ）、CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）、游离脂肪酸合成酶（FAS）、载脂蛋白E（APOE）、解偶联蛋白 1（UCP-1）。采用免疫荧光成像方法检测味觉受体T2R10和T2R14在3T3-L1脂肪细胞表达,以探讨苦味受体在脂滴代谢的作用。采用分子对接技术和钙流实验研究小豆蔻明对TRPA1受体的拮抗作用,采用实时无标记细胞分析技术检测小豆蔻明对心肌细胞活力的影响,并且构建蛋白-蛋白相互作用网络分析小豆蔻明的分子作用机制。最后,采用Chou-Talalay药物联用指数（CI）方法探讨两种化合物组合协同抑制脂滴堆积作用,包括盐酸小檗碱、槲皮素、洛伐他汀、阿司匹林和二甲双胍。进一步采用两种浓度组成方法验证优化槲皮素和二甲双胍的协同作用。（2）以GM03123细胞为胆固醇堆积细胞模型,10μM为初筛浓度,药物连续作用72 h,评价化合物降低胆固醇堆积作用。以4%多聚甲醛固定细胞,采用filipin标记细胞胆固醇,CMRA标记细胞质,采用高内涵荧光成像系统采集胆固醇荧光信号,分析平均每个细胞胆固醇含量。对初筛发现抑制率达到50%的化合物,在0-30 μM浓度梯度处理48 h-72 h进行复筛验证,以确定其浓度和时间效应关系。（3）以HepG2细胞为磷脂堆积模型,采用30 μM普萘洛尔诱导磷脂堆积。以丹参提取物和单体,化合物库165种单体为研究代表,评价其降低磷脂堆积作用。初筛时,待测化合物（10μM）和荧光染料LipidToxTM Phospholipidosis同时加入HepG2细胞,共同孵育48h。将细胞固定,标记细胞核,采用高内涵荧光成像方法,分析药物处理后每个细胞磷脂含量和细胞数量。二、自噬-溶酶体通路层次:TFEB核转位和LC3形成（4）转录因子EB（TFEB）为自噬-溶酶体通路的关键靶点,以TFEB过表达细胞系为高内涵筛选模型。在10 μM初筛浓度条件下,药物处理4 h,固定细胞,采用高内涵荧光成像系统采集信号,分析细胞核TFEB阳性细胞率和平均荧光强度。对初筛发现的活性化合物,在30 μM内按照1.5倍浓度梯度稀释,进一步复筛验证。采用Ca2+螯合剂BAPTA-AM（10 μM）预处理细胞30 min,探讨Ca2+在活性成分诱导TFEB核转位的作用。（5）微管相关蛋白轻链3（LC3）是自噬-溶酶体通路的另一重要标志物,以GFP-mCherry-LC3过表达细胞系为模型,一共分析了 26个代表性活性成分对LC3形成的影响。以小白菊内酯为代表,评价其对3T3-L1脂肪细胞溶酶体和线粒体活力的影响。将自噬诱导剂Torin 1和Rapamycin作用于分化的脂肪细胞,采用3-甲基腺嘌呤阻断自噬,探讨自噬对脂滴堆积的影响。研究结果:一、基于细胞表型发现调节脂代谢活性成分（1）建立了 3T3-L1抑制脂滴堆积的高内涵筛选方法,从中药化合物库中筛选出16个降低脂滴堆积活性成分并获得其IC50值。在单细胞水平评价脂滴形成和生物标志物的相关性,结果显示,脂滴量与PPARγ、C/EBPα、UCP-1、FAS和APOE均呈显著的正相关性（P＜0.05）。仙鹤草酚 B 激活 SIRT1,降低 PPARγ、C/EBPα、FAS、ApoE 和 UCP-1 表达。小豆蔻明和小白菊内酯均抑制PPARγ下游信号通路。同时,通过评价PPARγ表达作用进一步验证了其余12个化合物抑制脂滴堆积作用。免疫荧光实验显示,3T3-L1脂肪细胞表达苦味受体T2R10和T2R14蛋白,随着细胞分化成熟,受体的表达量升高,提示苦味受体可能与脂滴代谢有关。分子对接实验和钙流实验显示,小豆蔻明特异性拮抗TRPA1离子通道受体,IC50值为454 nM,且对心肌细胞无明显的抑制作用。蛋白-蛋白相互作用网络分析结果显示,小豆蔻明拮抗TRPA1受体和抑制脂滴堆积作用,可产生加合效应。对化合物组合的协同作用研究显示,槲皮素与二甲双胍组合的药物联用系数CI值＜0.7,为中等协同作用。阿司匹林、槲皮素、盐酸小檗碱组合的CI值＞1,产生拮抗作用。（2）基于GM03123细胞模型,从中药化合物库筛选出12个活性成分,四个化合物为丹参脂溶性化合物,IC50值均低于5 μM之间。其余活性成分来源于仙鹤草、黄连、麦冬、沙棘和金银花等。其中,3个多酚类化合物（Y15、F46和姜黄素）表现出“U”型浓度效应曲线。该研究首次揭示了 11个活性成分降低NPC1突变型胆固醇堆积作用,并获得候选成分的IC50值,为体内及临床试验研究提供了依据。（3）基于HepG2磷脂堆积模型发现,torin 1（250 μM）和rapamycin（1 μM）轻微降低磷脂堆积。仙鹤草来源的Y15剂量依赖地降低药物引起的磷脂堆积,而丹参的提取物及脂溶性单体化合物均未显著降低磷脂堆积。该研究表明,激活自噬-溶酶体通路具有轻微的降低磷脂堆积作用。二、基于自噬-溶酶体通路活性研究（4）基于TFEB核转位细胞模型,从中药化合物库中筛选出23活性化合物,四个化合物来源于丹参,EC50值均在6 μM之内。丹参醇提物诱导TFEB核转位的EC50值为9.42 μg·mL-1,丹参水提物仅表现微弱的作用,EC50值为33.4 μg·mL-1。其余活性成分主要来源于苦味中药仙鹤草、防己、莲子心、冬凌草和白屈菜等;辛味中药生姜、小白菊、姜黄和草豆蔻等。平行试验中,小檗碱和槲皮素在30μM内并未诱导TFEB核转位。螯合细胞内Ca2+后,C10、F07、F47、B17、D27和D06诱导TFEB核转位的阳性率显著降低（P＜0.05）,表明Ca2+参与该化合物诱导的TFEB核转位作用。相反,Y15和X39的活性显著增强（P＜0.05）。（5）对26个化合物的作用研究显示,共13个化合物显著诱导自噬体生成。其中,Y15以时间和剂量依赖的方式诱导LC3形成。丹参单体化合物和提取物轻微降低LC3含量。在相同条件下,八个化合物（异鼠李素、木犀草苷、蛇根碱、冬凌草甲素、焦性没食子酸、盐酸小檗碱、槲皮素和C10）在30μM内未诱导LC3形成。其中,C10可显著增强溶酶体和线粒体活性。此外,Rapamycin和Torin 1显著降低脂滴堆积,3-甲基腺嘌呤可阻断Rapamycin和Torin 1诱导的细胞自噬流,但并不能逆转其对脂滴的抑制作用。结论:本文整合五种细胞表型建立了高通量筛选方法,发现了一系列化合物调节脂代谢的新活性和干预自噬-溶酶体通路的新机制。其中,抑制脂滴堆积化合物16个、降低胆固醇堆积化合物12个、抑制磷脂堆积化合物1个、诱导TFEB核转位化合物23个,诱导LC3形成化合物13个。所获得的化合物具有如下作用规律:（1）发现四个化合物（Y15、D27、C10和D06）具有诱导TFEB核转位作用,并且降低3T3-L1脂肪细胞脂滴堆积。（2）发现七个化合物（T05、X02、F07、X29、X39、Y15和F46）具有诱导TFEB核转位作用,并且降低GM03123细胞胆固醇堆积。（3）五个作用于2型味觉受体的苦味化合物（盐酸小檗碱、槲皮素、穿心莲内酯、马兜铃酸A和R-人参皂苷Rh2）抑制3T3-L1脂肪细胞脂滴堆积,但对TFEB和LC3蛋白无明显作用。（4）仙鹤草Y15降低普萘洛尔和胺碘酮诱导的磷脂堆积,具有潜在的降低磷脂堆积毒性作用。