基于两端封闭发卡型DNA酶和dsDNA-SYBR GreenⅠ光敏催化的化学发光传感新技术

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核酸是组成生命体最主要的生物大分子之一,也是基因表达的基础,指导和调控着蛋白质的合成以及有机体细胞的相关机能。迄今为止,核酸已被作为一种重要的生物标志物用于生物研究和医学诊断。检测核酸的方法众多,主要有荧光分析法、比色分析法、电化学分析法和化学发光分析法等。催化是实现高灵敏分析的简单且有效手段之一,已广泛应用于生物分析、食品分析、环境分析以及医学分析等领域。本论文研究主要利用DNAzyme催化和DNA-染料复合物的光敏催化与化学发光传感技术结合,构建两种化学发光传感新体系,用于高灵敏检测miRNA/DNA,主要包括以下两个部分:  1、将目标链催化发卡自组装技术(CHA)与两端封闭G-四聚体DNAzyme结合,构建高信背比的miRNA传感新方法。以往,用于CHA技术的G-四聚体DNAzyme只有单端封闭,易形成分子间G-四聚体,不但增加了背景信号,而且会阻碍DNAzyme的激活,造成样品信号低。本研究提出的两端封闭G-四聚体DNAzyme通过在茎部和环部分别固定两端序列,从而避免分子间G-四聚体DNAzyme的形成。这种形式对DNAzyme封闭效率高,可达96%;而且易于通过目标链催化激活CHA过程,激活效率可达94%。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外吸收光谱、化学发光等手段,对体系的机理进行了验证。优化了体系H1的浓度、H2的浓度、氯高铁血红素(Hemin)的浓度、孵育温度和孵育时间后,该方法对miRNA-21检测的线性范围为0.50pM-0.50nM,检出限低至0.20pM(3σ)。随后,用miRNA let-7a、miRNA let-7c、miRNA let-7i、一个碱基错配的miRNA-21序列和三个碱基错配的miRNA-21序列进行了选择性考察。最后,考察了该方法在癌细胞裂解物和正常人细胞裂解物中的实际应用情况,结果显示癌细胞裂解物中靶标miRNA-21的化学发光信号明显高于正常人细胞裂解物的化学发光信号,并且随着癌细胞裂解物的增加化学发光信号呈线性增加。因此,该方法有望应用于实际生物样品中miRNA的测定。  2、构建了dsDNA-SG(双链DNA-SYBR GreenⅠ)复合物光敏催化化学发光检测DNA的传感新方法。发现dsDNA-SG复合物能光敏氧化K4[Fe(CN)6]为K3[Fe(CN)6],K3[Fe(CN)6]氧化鲁米诺产生化学发光,从而建立免标记光敏催化检测DNA的新方法。采用紫外吸收光谱、化学发光等手段对该体系的机理进行了验证,并优化了体系K4[Fe(CN)6]的浓度、核酸染料的种类、SG的浓度、激发波长、光照时间和鲁米诺pH。在最优实验条件下,该光敏催化化学发光体系检测BRCA1基因的线性范围为5.0pM-5.0nM,检出限为3.0pM(3σ);检测BRCA2基因的线性范围为10pM-5.0nM,检出限为6.0pM(3σ);检测p53基因的线性范围为10pM-5.0nM,检出限为5.0pM(3σ)。所建体系的灵敏度可与带有信号放大技术的方法相媲美。通过对选择性的考察,发现该光敏催化化学发光体系对靶标DNA有较强的选择性,并且该方法可以任意选择靶标DNA进行检测,具有实用性强、操作简单、成本低等优点,有望应用于实际生物样品的检测。
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