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目的:肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN),又称生长/分化因子8(GDF8),是TGF-β超家族成员之一,该基因对骨骼肌的生长发育具有负调控作用。该基因功能的缺失,能够引起肉用动物的“双肌”表型,从而提高动物的产肉率。Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9系统和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease,TALEN)是两种最新人工设计核酸酶,可用于各种复杂的基因组编辑。本研究通过设计CRISPR/Cas 9和TALEN两种人工核酸酶分别作用于绵羊MSTN基因第一外显子和第三外显子,通过电转染的方式将CRISPR/Cas9和TALEN质粒转入绵羊成纤维细胞,以期获得MSTN基因发生突变的绵羊成纤维细胞,为获得MSTN基因突变的转基因肉羊研究工作奠定基础。方法:试验一采用Golden Gate等构建方法,对构建好的质粒进行感受态转化和去内毒素质粒提取,利用琼脂糖电泳检测是否成功构建Cas9和TALEN质粒。试验二采用Lonza 4D-Nucleofector电转染设备和试验室配制的电转液L,将p MAX绿色荧光蛋白表达质粒导入绵羊成纤维细胞。通过对电转染程序、细胞数量、质粒浓度、不同电击次数以及电转后不同的放置温度等几个条件进行优化,经流式细胞仪测定和荧光显微镜观测细胞的转染效率,以期得到L电转液最佳电转方案。试验三通过电转染的方法将CRISPR/cas9和TALENs质粒电转到绵羊成纤维细胞,采用Surveyor nuclease、T7E1(T7Endonuclease 1)和HRM(High Resolution Melt)三种检测方法,检测作用于绵羊MNST基因第一外显子CRISPR/Cas9和第三外显子TALEN的生物学活性,确定目标靶点DNA是否发生突变。试验四将鉴定的具有CRISPR/Cas9和TALEN生物活性的细胞,进行有限稀释后,在体视显微镜下使用毛细管吸取单个细胞接种到96孔板中,每个孔中接种一个单细胞,经传代培养得到不同的单细胞系,将传代培养的单细胞通过HRM技术,PAGE检测和直接测序三种方法鉴定突变的单克隆细胞。结果:试验一结果显示经琼脂糖电泳检测到CRISPR/Cas9和TALEN质粒,其片段大小分别CRISPR/Cas9质粒9999bp,sg RNA质粒4930bp,TALENL/R质粒8322bp,成功构建CRISPR/Cas9和TALEN质粒。试验二结果显示L电转液最佳电转染方案:100μl的L电转液悬浮2×106个细胞,选择CZ-167电转程序,质粒总量为4μg,电击一次后37℃放置10min,可获得理想的电转染效率。试验三检测结果显示作用于绵羊MNST基因第一外显子CRISPR/Cas9和第三外显子TALENs的目标靶点均发生了突变。试验四结果显示将传代培养的单细胞通过HRM技术,PAGE检测和直接测序三种方法鉴定,成功筛选到单克隆突变细胞。结论:1、成功构建作用于绵羊MSTN基因第一外显子的CRISPR/Cas9质粒和第三外显子的TALEN质粒。2、采用电转染的方式将两种质粒转入绵羊成纤维细胞中,通过HRM、T7EI和Surveyor三种方法检测出CRISPR/Cas9和TALEN均发挥生物学活性,产生切割目标靶点的作用。3、转染的单细胞经体外培养扩增,并采用HRM、PAGE和直接测序三种方法,筛选出阳性单克隆突变的绵羊成纤维细胞。