论文部分内容阅读
背景与目的过敏性结膜炎（allergic conjunctivitis,ACJ）涵盖了一系列影响眼表的疾病,困扰着全世界大约15-20%的人口。眼部瘙痒是ACJ的特征性症状,严重影响了患者的生活质量。临床前证据表明在ACJ模型中,由免疫球蛋白E（Immunoglobulin E,IgE）激活的肥大细胞在ACJ早期过敏反应和晚期炎症反应中均发挥直接作用。肥大细胞驱动的致痒因子,如组胺和蛋白酶,对初级感觉神经元瘙痒相关受体的作用,被认为是瘙痒的经典外周神经机制。然而,针对肥大细胞及相关炎症因子的现有治疗方法,如组胺受体拮抗剂、肥大细胞稳定剂、类固醇激素等,往往难以有效缓解眼部瘙痒症状,甚至伴有副作用。因此,除了肥大细胞相关的炎症机制,其他机制也可能参与了 ACJ相关的眼部瘙痒。临床证据表明,ACJ患者通常存在抗原特异性免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）的升高,尤其是血清和泪液中IgE水平显著升高。IgE是过敏性疾病相关免疫球蛋白的一种亚型,由B细胞在免疫重组后产生。过敏原与特异性IgE结合的IgE型免疫复合物（IgE-immune complex,IgE-IC）,其可直接激活Fc-epsilon受体（FcεRs）,尤其是高亲和力激活型的FcεRI受体,并进一步引起超敏反应。FcεRI结构上包含α亚基（FcεRⅠα,结合IgE）、β亚基（FcεRIβ,信号放大作用）和γ亚基（FcεRⅠγ,信号转导作用）,组成多聚体复合物。FcεRⅠα通过连接IgE和肥大细胞、嗜碱性粒细胞等应答细胞在过敏性疾病中发挥核心作用。人源化单克隆IgE抗体奥马珠单抗可中和循环的IgE,从而阻止IgE与FcεRⅠ结合。临床证据显示,奥马珠单抗对组胺受体拮抗剂和肥大细胞稳定剂治疗无效的过敏性结膜炎眼部瘙痒有良好效果。因此,IgE-FcεRⅠ可能以肥大细胞炎症非依赖的方式引起ACJ相关的眼部瘙痒症状。除肥大细胞和嗜碱性粒细胞等免疫细胞外,外周感觉神经元也表达FcεRⅠ。并且,抗原特异性IgE致敏后的神经元可直接被抗原激活,表明该神经元表达的适应性免疫受体是具有功能的。然而,神经元表达的FcεRI受体对于眼部瘙痒的作用尚未探索。FcεRⅠ是否在支配结膜的感觉神经元中表达,以及IgE-IC是否通过神经元FcεRⅠ直接激活支配结膜的痒觉神经元,引起眼痒,仍需进一步研究。在本研究,我们旨在探讨神经元表达的FcεRⅠα在过敏性眼部瘙痒中的作用。材料与方法1.使用麦胚凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）在小鼠结膜显微注射,应用免疫荧光检测三叉神经节（Trigeminal ganglion,TG）内逆行标记的支配结膜的神经元FcεRⅠα表达。2.钙成像检测FcεRⅠα+/+和FcεRⅠα-/-小鼠分离培养的三叉神经节神经元对IgE-IC的反应性。3.对Na（?）ve小鼠分别滴眼卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）抗原,IgE抗体和IgE-IC免疫复合物后,观察小鼠眼部的瘙痒和疼痛相关行为。4.对FcεRⅠα-/-小鼠和c-KitW-sh/W-sh肥大细胞缺陷小鼠滴眼IgE-IC免疫复合物,进一步观察FcεRⅠα和肥大细胞对于IgE-IC相关眼部急性瘙痒的作用。5.三叉神经节注射包含Pirt启动子（感觉神经元特异的启动子）和干扰FcεRⅠα的shRNA序列的腺相关病毒（AAV9-Pirt-shFcεRⅠα-EGFP）,以特异性敲低三叉神经节感觉神经元的FcεRⅠα,并检测其对IgE-IC引发的眼部急性瘙痒的作用。6.为观察过敏反应状态下感觉神经元FcεRⅠα的表达,我们构建了卵清蛋白OVA介导的ACJ小鼠模型。应用蛋白免疫印迹和免疫荧光的方法,我们进一步检测了 ACJ病理情况下结膜WGA逆行标记的神经元FcεRⅠα表达。7.对于注射AAV9-Pirt-shFcεRⅠα-EGFP病毒的小鼠,进一步构建了 ACJ模型,观察敲低神经元FcεRⅠα对于抗原暴露引发的过敏性眼部瘙痒的影响。8.使用含有IgE的培养基对急性分离的三叉神经节神经元进行培养,检测IgE对FcεRⅠα的mRNA和蛋白表达的作用,并检测神经元对IgE-IC反应性的变化。9.应用OVA对小鼠致敏不同的次数,检测随着致敏次数增加对于三叉神经节中FcεRⅠα表达的变化,以及致敏次数增加对于抗原暴露后眼部过敏性瘙痒的影响。结果1.FcεRⅠα在小鼠支配结膜的TG神经元中表达,并且FcεRⅠα在结膜的神经纤维中表达,也在伤害性感觉神经元和MrgprA3+痒觉特异性神经元表达。2.IgE-IC通过FcεRⅠα直接激活TG感觉神经元。3.滴眼IgE-IC可引起小鼠急性眼部瘙痒,且不依赖于结膜和TG内部炎性细胞浸润以及肥大细胞活化。4.FcεRⅠα介导IgE-IC诱发的急性眼部瘙痒。5.感觉神经元FcεRⅠα介导IgE-IC诱发的急性眼部瘙痒。6.ACJ上调TG中支配结膜神经元的FcεRⅠα表达。7.感觉神经元FcεRⅠα介导ACJ模型小鼠过敏性眼部瘙痒。8.IgE上调TG神经元FcεRⅠα的表达,并提高TG神经元对IgE-IC的反应性。9.增加致敏次数可上调TG神经元FcεRⅠα的表达并增强小鼠过敏性眼部瘙痒。结论本研究表明,支配结膜的感觉神经元中FcεRⅠα直接介导IgE-IC诱导的眼部急性瘙痒。此外,ACJ上调支配结膜的感觉神经元的FcεRⅠα,并介导了抗原暴露所诱发的ACJ相关的眼部瘙痒。这些结果揭示了过敏性瘙痒状态下一种全新的神经免疫互作机制,并进一步强调了痒觉神经元的免疫感知特性。