严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Sydrome, SARS)是由SARS 冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV)引起的一种新的急性呼吸道传染病。该病以高热、头疼、肌痛酸痛和干咳为主要特征,进程性的呼吸系统衰竭;传播快、范围广、发病急,严重威胁患者生命,死亡率可达到10%。目前,通过传统的方法如快速检测、传染控制、隔离检疫和溯源等已经使SARS 得到控制。但是这些方法不是长久之计,SARS-CoV 的自然发展过程和致病机理必需要阐明,同时还要不断提高诊断方法、设计特异的抗病毒药物和疫苗。SARS-CoV 作为该病的病原体,在入侵肌体后,首先直接以病毒基因组RNA 为翻译模板,表达包括病毒RNA 聚合酶在内一系列多种复制酶蛋白(非结构蛋白),然后利用这些酶通过不连续转录的方式完成负链sgmRNA 的转录合成、各结构蛋白mRNA 的合成,以及病毒基因组RNA 的复制。其自身编码的复制酶蛋白具有多种酶活性:木瓜水解蛋白酶、3C 样胰凝乳蛋白酶、RNA 依赖性聚合酶、解旋酶、3’-5’外切核酸酶、内切核酸酶、2-核糖甲基转移酶等,这些复制酶蛋白在病毒基因组的转录调节、RNA 的复制以及病毒蛋白质的表达调控等多个方面具有重要作用。根据复制酶蛋白功能和结构,人们已经开发出多种抗SARS 冠状病毒的药物来治疗该传染病。目前对于复制酶蛋白中的nsp1、nsp2、nsp4、nsp6、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11 的功能尚不清楚。已知在病毒感染细胞后6h,就可以检测到有复制酶蛋白表达,通过荧光显微镜观察nsp8 和nsp9 都分布在细胞核周围以及细胞浆中的内质网和小泡中;并且nsp8 和nsp2、nsp3 形成复合体共同存在于细胞浆中,且和自吞噬小体的标志蛋白(LC3)共同存在。nsp9 具有与RNA 非特异性结合的能力并和nsp8 相互作用,使nsp8 表现出一种具有活性的功能形态。本实验从SARS 冠状病毒(BJ01 株)基因组中经RT-PCR 克隆得到病毒复制酶蛋白nsp8 全长594bp 的基因序列,连接到载体pGEX-6p-1 中,构建原核表达载体pNSP8E,pNSP8E 转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG 诱导表达出可溶性的22kDa 的nsp8 蛋白。通过pull-down试验,利用表达的GST-nsp8 融合蛋白从A549 细胞裂解液中钓取了nsp8 的受体蛋白。肽质量指纹图谱分析表明,nsp8 受体蛋白最可能为锌指蛋白zinc finger protein 324(ZNF324)。以ZNF324 蛋白作为研究对象,从人肺腺癌细胞A549 中,扩增了该蛋白部分片段的基因序列,构建了原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。nsp8 和ZNF324 蛋白间的体外相互作用还需pull-down 实验进一步证明。构建nsp8 的真核表达载体pNSP8,建立转染nsp8 的细胞系。以IgG-anti-nsp8(FITC)作为探针,进行激光扫描共聚焦显微镜观察,nsp8 蛋白分布在细胞浆中;双标法检测初步证实,在细胞内部nsp8 和ZNF324 形成共同的发光点,两者之间存在相互作用,还需进一步通过免疫共沉淀等实验加以证明。从SARS冠状病毒基因组中经RT-PCR克隆得到病毒复制酶蛋白nsp9全长339bp的基因序列,连接到载体pGEX-6p-1 中,构建原核表达载体pNSP9E,pNSP9E 转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG 诱导表达出可溶性的12kDa 的nsp9 蛋白。通过pull-down 试验,利用表达的GST-nsp9 融合蛋白从A549 细胞裂解液中钓取了nsp9 的受体蛋白。经肽质量指纹图谱分析和蛋白质N 末端测序,获得了nsp9 两个受体蛋白的信息。根据肽质量指纹图谱分析,nsp9 受体蛋白之一可能为T cell associated kelch repeat protein(TA-KRP);以TA-KRP 作为研究