【摘 要】
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枯草芽孢杆菌是自然界中存在最广泛的益生菌菌种之一,其菌体本身及代谢产物能够抑制动物机体内多种微生物病原菌的粘附和生长,对维持动物机体健康降低死亡率,提高养殖行业的质量做出巨大贡献。目前作为替抗产品在动物医药和饲料添加剂中受到高度的重视和应用,本课题筛选出拮抗效果良好的枯草芽孢杆菌,以抑菌活性为指标对其发酵工艺进行优化,并对发酵过程中合成的抑菌特性进行了初步探究,主要研究结论如下:（1）饲用芽孢杆菌
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枯草芽孢杆菌是自然界中存在最广泛的益生菌菌种之一,其菌体本身及代谢产物能够抑制动物机体内多种微生物病原菌的粘附和生长,对维持动物机体健康降低死亡率,提高养殖行业的质量做出巨大贡献。目前作为替抗产品在动物医药和饲料添加剂中受到高度的重视和应用,本课题筛选出拮抗效果良好的枯草芽孢杆菌,以抑菌活性为指标对其发酵工艺进行优化,并对发酵过程中合成的抑菌特性进行了初步探究,主要研究结论如下:（1）饲用芽孢杆菌的筛选。在选定的健康蛋鸡、肉鸡的新鲜排泄物中分离出12株芽孢杆菌,以大肠杆菌k88、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、铜绿假单胞菌、057血清型禽致病性大肠杆菌、078血清型禽致病性大肠杆菌等作为指示菌进行平板初筛得到4株具有良好抑菌效果的芽孢杆菌,其编号分别为菌株ZX-3、菌株ZX-7、菌株ZX-8和菌株ZX-11。将初筛得到的4株芽孢杆菌依次进行人工体外模拟肠胃液耐受力摇瓶复筛试验,实验结果表明:菌株ZX-3和ZX-11在体外模拟肠胃液中定植后的存活率均在70%以上,适合在畜牧生产中作为饲料添加剂使用。将复筛获得的菌株ZX-3、ZX-11进行形态学观察、生理生化鉴定以及分子生物学鉴定,鉴定结果为:菌株ZX-3为贝莱斯芽孢杆菌,菌株ZX-11为枯草芽孢杆菌。鉴于枯草芽孢杆菌为《饲用添加剂品种目录》中的益生菌,因此将菌株ZX-11选定为后续工艺优化及益生功能的研究对象。（2）枯草芽孢杆菌ZX-11的发酵培养工艺优化。以菌体生长和抑菌性能为指标,对枯草芽孢杆菌ZX-11发酵培养基组成进行单因素和响应面优化,确立培养基配方为蔗糖8.60 g/L,酵母浸粉5.0 g/L,胰蛋白胨8.40 g/L,Na Cl 6.40 g/L,p H 7.2±0.2。在此基础上,对其发酵温度、p H、发酵周期、接种量和摇床转速等培养条件进行了正交优化实验,获得最适反应条件为:初始接种量4%,初始p H 7.0,发酵时间18h,温度35℃,摇床转速200 r/min。采用优化后的培养基和培养条件,枯草芽孢杆菌ZX-11抑菌圈直径最终可达31.5mm,较优化前的抑菌圈直径20mm提高了50%左右。（3）枯草芽孢杆菌ZX-11抑菌特性研究。枯草芽孢杆菌ZX-11发酵上清液经硫酸铵沉淀法得到蛋白粗提产物,复溶后通过葡聚糖凝胶层析进行分离纯化,纯化后的蛋白提取物经抑菌活性验证后,进一步通过高效液相色谱对其纯度进行分析,结果显示该组分具有单一峰型纯度较高。经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果分析,得到纯度较高单一目的条带,综合质谱分析和数据比对,鉴定其中主要成分是分子量大小为26 KD的鞭毛蛋白。枯草芽孢杆菌ZX-11所产抗菌蛋白具有热稳定性,其中在50℃至100℃条件下处理仍然具有良好的抑菌活性,同时具有较好的酸碱稳定性,尤其是在中性和酸性条件下稳定性更强。
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