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一、清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞株增殖和凋亡的影响及其对IEC-6细胞分泌GLP-1的调控作用目的：观察清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞增殖和凋亡的影响以及对IEC-6细胞释放GLP-1的影响,探讨清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞释放GLP-1的影响是否与GPR119激活有关。方法：采用MTT比色法计算清热降浊方及黄连素干预后的IEC-6细胞存活率,观察清热降浊方对IEC-6细胞增殖的影响；采用Annexin V-FITC和PI双标流式术检测清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞凋亡的影响。应用放射免疫法,检测细胞上清液中GLP-1、cAMP含量,观察清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞分泌GLP-1的影响及可能的作用途径。结果：利用MTT法检测后得到的OD值,计算IEC-6细胞存活率,清热降浊方干预24h后,与正常胎牛血清培养相比,低浓度中药复方组细胞存活率显著增加(P<0.01),其中2.5%浓度含药血清组细胞存活率最高(162.42%),故选用2.5%浓度含药血清作为工作浓度。利用WST-1法检测后得到的OD值,计算IEC-6细胞存活率,黄连素干预24h后,与正常胎牛血清培养相比,低浓度黄连素组细胞存活率显著增加,其中1μg/mL黄连素组细胞存活率最高(220.17%),故选用1μg/mL黄连素浓度作为工作浓度。通过流式细胞术检测细胞凋亡率的结果显示,清热降浊方及黄连素干预24h后,不同葡萄糖状态下细胞的凋亡率均明显下降。相比高糖(正常培养,加胎牛血清)组,高糖加含药血清组细胞凋亡率下降了7.92%,高糖加黄连素组细胞凋亡率下降了6.23%；相比低糖(加胎牛血清)组,低糖加含药血清组细胞凋亡率下降了10.92%,低糖加黄连素组细胞凋亡率下降了8.51%；相比超高糖(加胎牛血清)组,超高糖加黄连素组细胞凋亡率下降了9.3%。放免法检测结果显示,高糖加含药血清组GLP-1含量为2.167±0.167pmol/g,高糖加黄连素组为1.870±0.098pmol/g,均明显高于高糖加胎牛血清组的GLP-1含量1.687±0.196pmol/g (P<0.01);低糖加含药血清组GLP-1含量1.942±0.119pmol/g,低糖加黄连素组为1.565±0.020pmol/g,均明显高于低糖加胎牛血清组的GLP-1含量1.441±0.102pmol/g (P<0.01);超高糖加黄连素组GLP-1含量为2.286±0.105pmol/g,明显高于超高糖加胎牛血清组的GLP-1含量1.856±0.015(P<0.01)。高糖加含药血清组cAMP含量为1.820±0.128pmol/mg,高糖加黄连素组为1.683±0.063pmol/mg,均明显高于高糖加胎牛血清组的cAMP含量1.539±0.065pmol/mg (P<0.01)；低糖加含药血清组cAMP含量1.457±0.057pmol/mg,低糖加黄连素组为1.428±0.053pmol/mg,均明显高于低糖加胎牛血清组的cAMP含量1.249±0.046pmol/mg (P<0.01)；超高糖加黄连素组cAMP含量为1.799±0.045pmol/g,明显高于超高糖加胎牛血清组的GLP-1含量1.655±0.069(P<0.01)。结论：清热降浊方能够促进IEC-6细胞增殖,减少细胞凋亡；促进IEC-6细胞分泌GLP-1,且其促GLP-1分泌作用,与GPR119-cAMP-GLP-1通路激活有关。黄连素在促进IEC-6细胞增殖、减少凋亡,促进GLP-1分泌方面的作用与清热降浊方一致。二、清热降浊方及黄连素对IEC-6细胞GLP-1和GPR119蛋白及基因表达的影响目的：从基因、蛋白水平探讨清热降浊方及黄连素促进IEC-6细胞分泌GLP-1作用是否与促进GPR119表达有关。方法：应用RT-PCR技术检测IEC-6细胞表面GLP-1和GPR119mRNA的表达,根据检测的Ct值结果,计算GLP-1和GPR119mRNA相对表达量；应用Western blot技术检测IEC-6细胞表面GLP-1和GPR119蛋白表达,通过计算相对灰度值,计算GLP-1和GPR119蛋白相对含量。结果：RT-PCR法检测GLP-1和GPR119mRNA表达,以正常培养(10%胎牛血清)组为基准样品,计算2-ΔΔCt值,比较相对表达量。高糖加复方含药血清组GLP-1mRNA相对表达量为4.90359±0.273842,高糖加黄连素组GLP-1mRNA相对表达量为4.75654±0.244486,超高糖加黄连素组GLP-1mRNA相对表达量为4.95339±0.216146,超高糖加胎牛血清组GLP-1mRNA相对表达量为4.47110±0.199938,低糖加复方含药血清组GLP-1mRNA相对表达量为1.04591±0.163524,低糖加黄连素组GLP-1mRNA相对表达量为0.94792±0.085629,低糖加胎牛血清组GLP-1mRNA相对表达量为0.54016±0.041613。高糖加复方含药血清组GPR119mRNA相对表达量为5.00823±0.294559,高糖加黄连素组GPR119mRNA相对表达量为4.75283±0.307996,超高糖加黄连素组GPR119mRNA相对表达量为4.91934±0.284853,超高糖加胎牛血清组GPR119mRNA相对表达量为4.35557±0.237960,低糖加复方含药血清组GPR119mRNA相对表达量为1.00210±0.107958,低糖加黄连素组GPR119mRNA相对表达量为0.95795±0.075175,低糖加胎牛血清组GPR119mRNA相对表达量为0.44108±0.034275。高糖加复方含药血清组、高糖加黄连素组GLP-1mRNA及GPR119mRNA相对表达量显著高于正常高糖培养组(P<0.01)；低糖加复方含药血清组、低糖加黄连素组GLP-1mRNA及GPR119mRNA相对表达量显著高于低糖加胎牛血清组(P<0.01)；超高糖加黄连素组GLP-1mRNA和GPR119mRNA相对表达量显著高于超高糖加胎牛血清组(P<0.01)。Western blot法检测GLP-1和GPR119蛋白表达,计算目的蛋白与β-actin灰度值之比,结果为,高糖加复方含药血清组GLP-1蛋白相对含量为1.66333±0.074976,高糖加黄连素组GLP-1蛋白相对含量为1.26583±0.025262,高糖加胎牛血清组GLP-1蛋白相对含量为0.90643±0.025290,低糖加复方含药血清组GLP-1蛋白相对含量为0.80650±0.024825,低糖加黄连素组GLP-1蛋白相对含量为0.79833±0.025201,低糖加胎牛血清组GLP-1蛋白相对含量为0.49217±0.043582,超高糖加黄连素组GLP-1蛋白相对含量为1.63833±0.052504,超高糖加胎牛血清组GLP-1蛋白相对含量为1.24667±0.035387。高糖加复方含药血清组GPR119蛋白相对含量为1.59017±0.056912,高糖加黄连素组GPR119蛋白相对含量为1.37133±0.035478,高糖加胎牛血清组GPR119蛋白相对含量为0.77183±0.025725,低糖加复方含药血清组GPR119蛋白相对含量为0.67033±0.040820,低糖加黄连素组GPR119蛋白相对含量为0.66643±0.022541,低糖加胎牛血清组GPR119蛋白相对含量为0.45283±0.024879,超高糖加黄连素组GPR119蛋白相对含量为1.60883±0.057881,超高糖加胎牛血清组GPR119蛋白相对含量为0.98058±0.062956。高糖加复方含药血清组、高糖加黄连素组GLP和GPR119蛋白相对含量显著高于正常高糖培养(高糖加胎牛血清)组(P<0.01)；低糖加复方含药血清组、低糖加黄连素组GLP和GPR119蛋白相对含量显著高于低糖加胎牛血清组(P<0.01)；超高糖加黄连素组GLP和GPR119蛋白相对含量显著高于超高糖加胎牛血清组(P<0.01)。结论：清热降浊方和黄连素能够促进IEC-6细胞表面GLP-1的表达,其促进表达的机制与清热降浊方及黄连素对细胞表面GPR119表达的上调作用有关。