【摘 要】
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从成都及其附近地区富含油脂的土壤中采集样品,利用以橄榄油为主要基质的富集培养基培养、以三丁酸甘油酯为主要基质的平板初筛和摇瓶复筛的筛选模型,反复筛选确定了2株碱性
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从成都及其附近地区富含油脂的土壤中采集样品,利用以橄榄油为主要基质的富集培养基培养、以三丁酸甘油酯为主要基质的平板初筛和摇瓶复筛的筛选模型,反复筛选确定了2株碱性脂肪酶活性较高的菌株(WA和WP).经过形态观察和生理生化特性分析,将WA菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),WP菌株鉴定为火神发光杆菌(Photobacterium logei).迄今尚未有解淀粉芽孢杆菌能产生碱性脂肪酶的报道.通过单因素分析和正交分析法,优化了解淀粉芽孢杆菌WA产脂肪酶的发酵条件,确定此菌最佳产酶条件为:1.0﹪橄榄油,1﹪淀粉为碳源,2﹪黄豆粉和2﹪玉米粉为氮源,培养基起始pH 7.0,接种量为7﹪,培养温度为30℃,100mL三角瓶装量为15mL,180rpm培养72h.在此发酵条件下,该菌发酵上清液中酶活可达12 U/mL.对发酵液性质进行初步研究发现,此酶最适反应温度为37℃,最佳反应pH为8.5,在pH7.0~10范围内活性稳定,并具有一定的热稳定性.10 mmol/LCa<2+>和K<+>对酶有激活作用,而Cu<2+>和Fe<3+>则对该酶有抑制作用.将解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)总DNA经Sau3 AI部分酶解后,利用琼脂糖凝胶回收4~10kbDNA片段,然后与BamHI酶切及脱磷酸化处理过的pUC19载体连接,以大肠杆菌DH5α为受体,构建了解淀粉芽孢杆菌的基因组文库.该文库有5000~6000个克隆,其中80﹪以上克隆中的插入片段大小在4~10kb之间.此文库为各种基因的筛选奠定了很好的基础.
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