论文部分内容阅读
2003年巴氏杆菌科成立一个新属——鸡杆菌属（Gallibacterium），鸭源鸡杆菌（Gallibacterium anatis，G. anatis）是鸡杆菌属的代表种。人们对鸡杆菌的研究可追溯至上世纪50年代，而由于其引发宿主的病症与其他病原相似，一直没有给出统一的命名。目前，部分学者认为鸡杆菌是一类条件致病性细菌，能够在宿主体内上呼吸道和下生殖道等部位生存。当机体受到外界刺激时，鸡杆菌随即大量增殖，可能冲破其免疫屏障并损害宿主。大量人工感染试验证明鸡杆菌具有侵袭性，能够由侵入部位扩散到内脏各器官。但根据目前的试验结果，对鸡杆菌的致病机制仍然无法了解透彻。因此，大家关于鸡杆菌的致病性仍然没有统一的定论。2010年，丹麦学者Kristensen等首次发现鸭源鸡杆菌的体外分泌蛋白（Gallibacterium toxin A，GtxA），该毒素蛋白具有损伤白细胞活性和溶血活性。本课题首次开展了鸭源鸡杆菌对小鼠的致病性研究；在体外原核表达了鸭源鸡杆菌蛋白GtxA，并且探究GtxA对鸡外周血淋巴细胞的毒性影响；利用GtxA蛋白为包被抗原，建立抗GtxA蛋白间接ELISA方法，并在实际生产中得到应用。1.鸭源鸡杆菌对小鼠的致病性试验为了解鸭源鸡杆菌对小鼠的致病性，将实验室自行分离、鉴定并保存的8株鸭源鸡杆菌分别腹腔注射小鼠，观察小鼠攻毒后的反应及病症变化。结果表明本研究8株受试鸭源鸡杆菌株中，同一CFU的不同菌株呈现出不同的致病力，其中YU-PDS-RZ-1-SLG株细菌毒力较强。攻毒死亡的小鼠各组织器官出现明显的败血症的病变，肝、脾尤为突出，其次为肠道，心、肺等器官病变不明显。其中YU-PDS-RZ-1-SLG株、YU-XX-HJ-4-SLG株和SHAN-XY-1-GZ株引起的致肝、脾脏病变较为严重。结果显示出从感染母鸡输卵管中分离出的鸭源鸡杆菌毒力强于从其他脏器分离出的菌株，表明鸭源鸡杆菌的毒力强弱可能与其脏器的不同分离部位有关。2.鸭源鸡杆菌GtxA体外表达与其对鸡外周血淋巴细胞的毒性作用为了解鸭源鸡杆菌毒素蛋白GtxA的毒力作用，利用大肠杆菌表达系统体外表达重组蛋白GtxA、该蛋白的N端结构域和C端结构域。体外重组蛋白经过活性鉴定后作用到鸡外周血淋巴细胞。通过MTT法检测细胞的受损程度，表明重组蛋白不但能够抑制淋巴细胞的增殖，而且表现出明显的细胞毒性作用。N端结构域作为独立的元件不能表现毒性作用，但是能够促进毒素蛋白GtxA发挥毒性作用。外周血淋巴细胞在受到GtxA蛋白刺激后，使得自身细胞生长受阻，抑制细胞因子的分泌。3.抗鸭源鸡杆菌蛋白GtxA抗体间接ELISA方法的建立与初步应用目前，人们认为鸭源鸡杆菌拥有多个血清型且血清型之间的交叉保护能力较差。最新发现的毒力蛋白GtxA可能存在多个血清型之间。将体外表达的GtxA蛋白作为包被抗原，建立抗鸭源鸡杆菌毒素蛋白GtxA抗体间接ELISA检测方法。通过对2013年河南省不同地市680份鸡血清进行抗体水平检测，检测出阳性样品129份，阳性检出率为19.06%。而用已报道的ELISA方法检测出阳性样品147份，阳性率为21.62%。两种方法检测出同为阳性的血清有125份，同时为阴性的有544份。故本文建立的方法阳性符合率为96.89%（125/129），阴性符合率为98.73%（544/551），总符合率为98.38%（669/680）。结果显示几乎全部受检鸡场均出现G. anatis抗体阳性的情况，平均抗体阳性率为19.06%，其中郑州地区的感染率较高。较之2011年我国部分地区鸭源鸡杆菌流行情况相比，在河南省地区鸡杆菌流行情况有所减少，而感染高峰地区由许昌转移到了郑州，可能由于采集样品的数量有限所致。