[研究背景和目的]肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者体内的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs),即循环肝癌细胞,是HCC转移和复发的根源。检测循环肝癌细胞对于预测HCC转移复发无疑具有重要临床意义。采用反转录聚合酶链式反应(reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测HCC患者外周血中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP) mRNA从而检测HCC患者CTCs的报道较多。然而,RT-PCR法有其固有局限,如易产生假阳性和假阴性、操作难以标准化、不能准确估算样本中CTC的数目等。此外,更不可忽视的是,RT-PCR法须破坏细胞形态,不能对单个CTC进行观察、分析和计数,而这些数据可提供CTCs恶性程度和侵袭性方面的信息。因此迫切需要建立特异和敏感的循环肝癌细胞分离和检测技术。目前分离CTCs的标准方法是基于肿瘤细胞表面上皮性抗原的磁性激活细胞分选技术(magnetic-activated cell separation, MACS)。由于缺乏针对肝癌细胞表面特异性抗原的单克隆抗体,迄今鲜见MACS用于分离循环肝癌细胞的报道。基于上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗体磁珠的CellSearch系统已被美国FDA批准用于检测乳腺癌、结肠癌和前列腺癌CTCs。尽管肝癌细胞属于上皮性细胞,但EpCAM仅在约35%左右的HCC组织标本中表达。因此,CellSearch系统并不适合用于分离、检测循环肝癌细胞。去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor, ASGPR)是一种特异表达于肝实质细胞表面的跨膜蛋白,能结合和内吞以半乳糖基和N-乙酰半乳糖胺基为端基的分子。这一特性已被用于设计多种实验研究。比如,利用放射性核素标记这样的糖蛋白,选择性地与肝细胞膜上的ASGPR相结合,可以进行肝显像；而以这样的糖蛋白为载体将抗肿瘤药物、降胆固醇药物、甚至治疗基因导向肝实质细胞,则是药物肝靶向递送的一个重要研究命题。利用这一个特性,本课题创建了一种基于ASGPR的磁性分选和肝细胞特异性抗体Hep Par 1免疫鉴定的循环肝癌细胞分离/鉴定系统,即以生物素化去唾液酸胎球蛋白作为配体与肝癌细胞结合,然后用抗生物素抗体磁珠进行间接磁性标记,从而磁性捕获循环肝癌细胞,接着用Hep Par 1抗体进行免疫荧光染色鉴定,并对阳性细胞进行计数。由于肝细胞通常不会脱落进入血循环,除非演变成肿瘤细胞,因此检测到的细胞即为循环肝癌细胞。该系统解决了以前所报道方法的固有问题,具有高度的特异性和敏感性。通过利用该系统对HCC患者、良性肝病患者和健康志愿者临床样本的检测,探讨了该系统临床应用的可行性。【研究方法】1、采用生物素化试剂Sulfo-NHS-1C-Biotin和去唾液酸胎球蛋白制备生物素化去唾液酸胎球蛋白,并进行离心超滤纯化。2、采用流式细胞术验证生物素化去唾液酸胎球蛋白与肝癌细胞的结合活性及确定最佳工作浓度。3、采用流式细胞术分析生物素化去唾液酸胎球蛋白与肝癌细胞结合的特异性。4、采用生物素化去唾液酸胎球蛋白、抗生物素抗体磁珠进行间接磁性标记肝癌细胞,通过磁场分离肝癌细胞。5、采用肝细胞特异性抗体Hep Par 1进行免疫荧光染色,鉴定和计数分选到的肝癌细胞。6、通过Hep3B细胞掺入试验分析所建立的循环肝癌细胞分离/检测系统的回收率、特异性和敏感性。7、通过Hep3B细胞掺入试验比较基于生物素化去唾液酸胎球蛋白/抗生物素抗体磁珠的循环肝癌细胞分离方法与基于EpCAM抗体磁珠的分离方法的回收率。8、采用所建立的循环肝癌细胞分离/检测系统检测各种患者5 mL外周血样本中的CTCs。包括：235例不同分期的HCC患者、20例健康志愿者、37例良性肝病患者(包括16例肝硬化、4例慢性乙型肝炎、6例急性甲型肝炎、8例肝海绵状血管瘤和3例肝囊肿患者)以及19例其他5种类型晚期肿瘤患者(包括3例睾丸癌、4例甲状腺癌、4例结肠癌、3例肾癌和5例乳腺癌患者)。9、采用所建立的循环肝癌细胞分离/检测系统检测11例良性肝占位性病变患者(包括8例肝海绵状血管瘤、3例肝囊肿)手术切除后第1天、第4天、第7天、第10天和第14天的CTCs。10、采用CK3-6H5抗体和TUNEL法双染鉴定HCC患者外周血中凋亡的CTCs。11、采用CD133抗体进行免疫荧光染色鉴定HCC患者外周血中具有肝癌干细胞表型的CTCs。12、采用Spearman相关分析、Fisher’s确切概率法和Mann-Whitney检验,分析CTCs阳性率以及CTCs数目与HCC患者临床特征的相关性。[实验结果]1、流式细胞术结果显示,生物素化去唾液酸胎球蛋白与肝癌细胞的反应活性好,其最佳工作浓度为0.4 mg/mL。2、流式细胞术结果显示,生物素化去唾液酸胎球蛋白与肝癌细胞的结合具有高度特异性。3、Hep3B细胞掺入试验显示,5 mL健康志愿者外周血中分别掺入10、30、90、270和810个Hep3B细胞,在每个掺入水平,Hep3B细胞的平均回收率均≥61%,并且在只掺入10个细胞的所有5个样本中,没有1个样本检测到的肿瘤细胞数少于5个。4、在掺入MCF-7人乳腺癌细胞和A498人肾癌细胞的所有标本中,均无细胞角蛋白阳性细胞检出。5、Hep3B细胞掺入试验显示,生物素化去唾液酸胎球蛋白/抗体生物素抗体磁珠回收率显著高于EpCAM抗体磁珠(P<0.05)。6、20例健康志愿者、37例良性肝病患者以及19例其他5种类型晚期肿瘤病例的5mL外周血样本中均未检出CTCs。7、11例良性肝占位性病变(包括8例肝海绵状血管瘤、3例肝囊肿)术前无1例检出CTCs,手术后第1天、第4天、第7天和第10天可检测到：Hep Par 1阳性细胞,且第1天、第4天、第7天和第10天检出的Hep Par 1阳性细胞数依次逐渐减少,而第14天则全部病例均检测不到CTCs。8、235例HCC患者中,CTCs阳性率为83%(195/235),CTCs检出数范围0-153个/5 mL外周血,均数为21±25个。9、部分HCC患者外周血中检出CD133阳性的CTCs。10、HCC患者的CTCs中有一部分是凋亡的CTCs。11、统计分析显示,在受检的235例HCC患者中,CTCs阳性率和CTCs数目与肿瘤大小、门静脉癌栓、TNM分期、Milan标准符合情况具有显著相关性,但与年龄、性别、病因、Child-Pugh分级和血清AFP浓度均无相关性。【结论】本研究创建了一种独特的基于ASGPR及其配体相互作用的循环肝癌细胞磁性分离方法,结合基于肝细胞特异性抗体Hep Par 1的免疫荧光染色鉴定方法,形成了一种新颖的循环肝癌细胞分离/检测系统。该系统具有高度的特异性和敏感性,是一种具有临床应用潜能的循环肝癌细胞检测方法。HCC患者CTCs阳性率和数目均与HCC进展程度成显著正相关。手术会引起患者正常肝细胞脱落至外周血循环中,但其在循环中会白行凋亡或被清除,不能长期存活。HCC患者的CTCs中一部分是已凋亡的CTCs,部分HCC患者体内存在具有肝癌干细胞表型的CTCs。