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随着生命科学的不断发展,患者遗传信息在临床个体化用药中的作用日益突出。基因突变检测技术被广泛应用于个体化用药相关基因标志物的检测当中,尤其在筛查用药相关基因多态性、指导肿瘤靶向药物使用以及监测耐药突变基因产生等方面有着重要意义。但随着临床需求的增大,现有的基因突变检测方法的问题也逐渐显现出来,主要包括检测灵敏度低、技术难度大、检测成本高、检测耗时长以及容易引起扩增产物污染等。针对目前存在的问题,本研究以酪氨酸激酶抑制剂相关的EGFR基因21号外显子的L858R位点（药物敏感性突变）和20号外显子的T790M位点（耐药性突变）为检测对象,建立了两种基于RPA恒温扩增的基因突变检测方法,以期为临床的基因突变检测提供高灵敏度、高特异性、快速简便、通用性强的新手段,并对方法进行优化和改进,以期建立更加适用于临床个体化用药的基因突变检测新技术。首先,在课题组前期基于高灵敏度的RPA扩增反应及高特异性的核酸侵入反应（Invasive reaction,简称Invader反应）的研究基础上,通过设计筛选RPA引物、优化Invader反应所需的下游检测探针及FEN1酶、RPA反应所需的酶混合物20×Core Reaction Mix及反应时间,建立了基于RPA-Invader反应的基因突变恒温检测方法。该方法在37℃下进行RPA反应20 min后升温至63℃触发Invader反应,10 min内即可准确检测。检测灵敏度达10~0拷贝/反应,特异性高达0.02%,其中L858R位点甚至可以检测突变含量低至0.01%的混合模板,说明该方法可以对微量突变实现高灵敏度、高特异性、无污染、耗时短的准确检测,满足临床检测需求。利用上述建立好的RPA-Invader方法对非小细胞肺癌患者的癌组织样本所提取的基因组DNA和血液样本提取的cfDNA分别进行EGFR基因突变位点检测,并与临床检测结果对比,对该方法进行临床验证。通过重新设计和筛选用于扩增短片段的RPA引物、优化RPA引物序列及扩增位置,证明了扩增长片段引物对的扩增灵敏度更高,同时也首次提出扩增短片段引物对仍然可以用于RPA扩增反应,通过偶联识别特异性结构的Invader信号放大反应,灵敏度可达10~1拷贝/反应。其次,考虑到RPA-Invader方法仍然需要使用专业的荧光检测设备,在基层或资源匮乏地区无法实现基因突变的即时检测（point-of-care testing,POCT）。基于此,我们提出了RPA偶联级联Invader-纳米金杂交反应,通过纳米金探针杂交技术,将对待测靶标的检测转变为纳米金溶液的颜色变化,三步恒温反应90min内即可通过肉眼判读结果,对基因突变实现可视化检测。该方法对L858R位点和T790M位点质粒模板的检测灵敏度分别为10~0拷贝/反应和10~1拷贝/反应,特异性均达0.1%,且均未产生非特异性背景信号。通过对所建检测方法进行大量的临床实际样本验证,不管是临床癌组织样本提取的基因组DNA还是血液样本提取的cfDNA,两种方法的检测结果与临床检测结果的一致性均在95%以上,证明了方法的可行性与准确性。综上所述,本课题的研究结果为建立快速简便、低成本、高灵敏度、高特异性、通用性强且无需复杂设备的基因突变恒温扩增检测提供了新思路。临床样本的检测表明本课题所建立的方法能够很好地应用于临床个体化用药相关基因突变的检测中,可根据实际场所的需求选择荧光法或肉眼判读结果,具有较大的临床应用价值。