【摘 要】
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世界上大约有3%(1.7亿)的人感染了丙型肝炎病毒(HCV),HCV可引起严重的肝脏疾病,如慢性肝炎、肝硬化乃至肝癌。由于缺少针对丙肝的疫苗,且目前的治疗方法有一定的局限性,研究新型
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世界上大约有3%(1.7亿)的人感染了丙型肝炎病毒(HCV),HCV可引起严重的肝脏疾病,如慢性肝炎、肝硬化乃至肝癌。由于缺少针对丙肝的疫苗,且目前的治疗方法有一定的局限性,研究新型、高效的抗HCV药物的重任迫在眉睫。NS2蛋白能够影响子代病毒颗粒装配,也能通过干扰宿主细胞的生理过程来促进病毒的复制。以NS2蛋白作为药物研究的靶点,具有巨大的潜力。核酸适体是一类新型的识别分子,具有亲和力强、选择性高、稳定性好、易于修饰等优点,广泛用于生物检测和新药开发等方面。在HCV编码的非结构蛋白中,针对NS2蛋白的药物尚未见报道。本文以NS2蛋白为靶标,筛选出特异结合的核酸适体,并研究了适体对病毒生活周期的影响,取得了以下结果:(1)采用普通PCR方法成功扩增出HCV NS2基因,并将目的基因成功构建到pET28b原核表达载体中。(2)将重组质粒pET28b-NS2转到BL21感受态细胞中进行蛋白大量表达,发现此蛋白可溶性低。采用超速离心法,并加入膜表面活性剂—月桂酸,可获得可溶性强的目的蛋白,用镍柱进一步纯化得到蛋白。(3)以纯化的NS2蛋白为靶标,经过5轮筛选,得到特异结合的ssNDAaptamers。从中选择三条适体(NS2-1、NS2-2、NS2-3)分析发现,这3种核酸适体能够特异结合到NS2蛋白上,不会与对照蛋白HCV NS5B和LacZ发生非特异性结合。(4)用荧光定量PCR和免疫荧光法检测转染核酸适体后细胞中的病毒复制和释放能力变化,发现核酸适体以一种呈剂量依赖型的方式抑制病毒复制,此外核酸适体NS2-2、NS2-3还能够抑制病毒颗粒的释放。结果表明针对NS2蛋白的核酸适体能够抑制病毒的复制和释放,有望研究成一种新型的靶向治疗HCV的药物。
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