论文部分内容阅读
胃癌（gastric carcinoma, GC）是最常见的恶性肿瘤之一,是我国高发肿瘤,胃癌死亡率目前排在肺癌和肝癌之后,位居第三位,五年生存率仅有20%左右,严重威胁着人类的生存和健康。近年来研究发现,长链非编码RNA （long non-coding RNA,lncRNA）在多个层面参与细胞分化、个体发育等多种生物学行为。然而,对于大部分的非编码RNA的功能我们仍知之甚少。本研究旨在寻找在幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori, HP）感染相关胃癌中发挥重要功能的lncRNAs,并研究其功能和机制,为胃癌的诊断和治疗提供分子生物学基础。我们在前期研究中基于HP国际标准株NCTC11637体外感染的人胃黏膜正常上皮GES-1细胞、人正常胃黏膜组织（HP阴性）、慢性萎缩性胃炎组织（HP阳性）和胃癌组织（HP阳性）临床样本,利用高通量的检测方法,研究HP阳性的相关胃癌中lncRNA的动态表达变化规律,寻找正常组、慢性炎症组、癌症组中的差异lncRNA,并与HP感染的GES-1细胞的lncRNA差异表达谱比对,利用生物信息学方法对lncRNA表达谱进行了初步筛选。在HP感染的人胃黏膜正常上皮细胞（GES-1）芯片中发现124个上调倍数大于10倍的lncRNAs及81个下调倍数大于10倍的lncRNAs-在胃癌组织芯片中,发现在胃癌及胃炎组织中均上调的lncRNA259个,均下调的lncRNA221个。将GES-1细胞中差异表达的lncRNAs与组织样本中差异表达的lncRNAs进行比对筛选,共发现18个在两个芯片检测中均有差异表达的lncRNAs。在炎症细胞模型（HP感染的GES-1细胞）中进行Real-time PCR进行验证,发现其中NR038975、NR003605、LncHP、PVT1在感染后GES-1细胞中呈现明显上调,且表达丰度较高,而LINC00260表达呈显著下调,结果与芯片趋势相符。进一步通过Real-time PCR对上述lncRNAs在胃癌组织及癌旁表达量进行检测,结果显示NR038975、LncHP在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织,差异显著,与组织芯片趋势相符,而LINC00260在已有胃癌组织及癌旁组织验证过程中发现其表达也出现了一定的上调,但结果无统计学意义。PVT1已有文章验证过在胃癌组织中的表达,遂本研究未对其再进行组织验证。综合上述验证结果及表达差异、表达丰度、生物信息学分析等因素,进一步选取2个上调基因LncHP和PVT1,1个下调基因LINC00260进行深入的功能研究。分别敲低目的基因后,通过细胞增殖检测实验（MTS）及划痕愈合实验检测该基因对细胞增殖及迁移能力的影响,发现敲低LncHP、PVT1及LINC00260后对细胞的增殖能力无显著影响,但是会不同程度的抑制细胞迁移。为了探究以上目的基因在HP感染引起的炎症反应中可能发挥的功能,在胃癌细胞中分别敲低以上基因后,再用HP感染细胞。发现在分别敲低LncHP、PVT1及LINC00260后,在HP感染的胃癌细胞中,炎症细胞因子TNFα、IL-1β、IL-8的表达受到明显的抑制。为了更进一步研究目的基因序列的功能,通过生物信息学分析及polyA尾鉴定实验对LncHP及LINC00260的序列特征进行了分析。结果显示,LncHP和LINC00260的序列均具有polyA尾结构。LncHP及LINC00260均具有复杂的二级结构,均不具有完整的开放阅读框（open read frame, ORF）,不能编码蛋白。由于LncHP在炎症细胞模型和组织中的表达差异最显著,所以最终选择LncHP进行深入研究。通过FISH实验和胞浆胞核分离实验结果显示,LncHP主要定位于胃癌细胞的细胞核中,在HP感染胃癌细胞后,LncHP从胞核转移到胞浆中,推测LncHP可能在HP感染细胞后,通过某种机制进入到细胞浆中发挥功能。进一步利用5’RACE和3’RACE技术获得了LncHP的全长转录产物为1164bp,比NCBI上预测的转录本长度短22 bp,并预测了LncHP可能具有的两个剪接体序列结构。综上所述,本论文首次在细胞和组织两个层面系统研究了lncRNAs在HP感染相关胃癌中的表达差异。深入研究LncHP、PVT1、LINC00260在胃癌中的差异表达及功能,研究表明,LncHP、PVT1在炎症细胞模型和胃癌组织中表达显著上调。LINC00260在炎症细胞模型中明显下调。敲低LncHP、PVT1、LINC00260表达可抑制胃癌细胞的迁移,在免疫炎症研究方面,敲低LncHP、PVT1、LINC00260能够抑制炎症细胞因子TNFα、IL-1β、IL-8的表达,说明LncHP、PVT1、LINC00260可能作为促炎因子发挥调节作用。FISH实验和胞浆胞核分离实验结果说明,LncHP可能通过某种作用机制在HP感染后的细胞中转移到胞浆中发挥作用。因此总结以上,本研究发现了可能与HP感染相关胃癌的lncRNA LncHP,期望能为胃癌的预防、诊断和治疗提供了新的思路和检测靶标。