背景：结直肠癌的发病率处于恶性肿瘤的第三位,随着人们饮食习惯和结构的改变及人口的老龄化,其发病率和死亡率呈上升趋势。由于结直肠癌的早期症状不明显,一旦确诊大部分已属中、晚期,5年总生存率徘徊在50%左右。结直肠癌以手术治疗为主,配合化疗、放疗、靶向治疗等综合治疗手段。结直肠癌的发生与多基因异常表达有关,调节肿瘤发生过程中某些关键基因的表达以阻断恶性转化,是控制肿瘤的有效手段之一。目前结直肠癌最为主要的靶点是血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)和表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor EGFR),贝伐单抗和西妥昔单抗联合化疗在晚期结直肠癌中显示较好的临床疗效。寻找结直肠癌新的关键致癌基因和信号传导通路的分子靶标,研究靶向药物,可能是未来结直肠癌靶向治疗的突破点之一。血管生成样蛋白2(Angiopoietin-like protein2,ANGPTL2)是新近发现的一种分泌型细胞外基质糖蛋白,属于血管生成样蛋白家族成员。ANGPTL2能够被慢性缺氧所诱导,并参与诱导血管生成和血管内皮细胞的迁移。ANGPTL2蛋白与炎症、肥胖和胰岛素抵抗密切相关。ANGPTL2在类风湿性关节炎、Ⅱ型糖尿病、冠状动脉疾病和恶性肿瘤等疾病过程中扮演着重要作用。到目前为止,ANGPTL2蛋白在恶性肿瘤中的表达、作用机制、上游调控基因等国内外罕见报道。MiRNA(microRNA)是具有22个核苷酸长度的小分子非编码RNA,在转录水平上通过降解或者抑制mRNA的翻译调控了大约30%的人类基因的表达。MiRNA参与调控了一系列的细胞事件包括细胞增殖、发育、细胞代谢和凋亡等功能。因此,miRNA的功能失调将导致恶性肿瘤的发生和发展。：niRNA-25在多种人类恶性实体瘤包括胃癌、食管鳞状细胞癌、肝癌和胰腺癌中表达上调。miRNA-25既能够作为癌基因又能作为肿瘤抑制基因,因此其功能非常复杂。miRNA-25在结肠癌中的作用及其是否参与对ANGPTL2的调控值得深入研究,为结肠癌的基因治疗提供潜在的分子靶标。第一部分ANGPTL2结肠癌中的表达及其临床意义目的：检测ANGPTL2在结肠癌组织和细胞株中的表达水平,探讨ANGPTL2的表达与结肠癌临床病理特征的相关性。方法：(1)利用免疫组织化学技术检测50例结肠癌组织和相应的50例癌旁正常组织中ANGPTL2蛋白的表达水平,统计分析ANGPTL2的表达与结肠癌临床病理特征的相关性。(2)通过real-time PCR和western blot方法检测ANGPTL2在正常肠上皮细胞株HCEpic和结肠癌细胞株HCT-116、HT-29、 SW480和SW620中的表达情况。结果：(1)ANGPTL2蛋白在结肠癌组织中的表达较癌旁正常组织中的表达明显升高,且ANGPTL2蛋白的表达水平与结肠癌的病理分级、T分期和淋巴结转移密切相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2) ANGPTL2的mRNA和蛋白表达水平在结肠癌细胞株明显高于正常人结肠上皮细胞株,且在高侵袭性结肠癌细胞株HCT-116和SW620中的表达明显高于低侵袭性结肠癌细胞株HT-29和SW480。结论：ANGPTL2在结肠癌组织和细胞株中的表达均明显升高,且ANGPTL2的表达与结肠癌的病理分级、T分期以及淋巴结转移密切相关,提示ANGPTL2在结肠癌的发生、发展过程中具有重要作用。第二部分ANGPTL2对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响目的：观察调控ANGPTL2的表达对结肠癌细胞的增殖和侵袭能力等生物学行为的影响。方法：(1)构建慢病毒介导的过表达载体Lv-ANGPTL2和干扰载体Lv-ANGPTL2-shRNA。将载体分别转染进入人结肠癌细胞株HCT-116和SW620,并筛选得到稳定ANGPTL2过表达细胞克隆(HCT-116/Lv-ANGPTL2和SW620/Lv-ANGPTL2)和稳定ANGPTL2干扰细胞克隆(HCT-116/Lv-ANGPTL2-shRNA和SW620/Lv-ANGPTL2-shRNA)。 Real-time PCR和western blot方法检测ANGPTL2的上调和沉默效果(2)MTT和克隆形成实验检测过表达ANGPTL2细胞克隆和干扰ANGPTL2细胞克隆的增殖能力。(3)Transwell小室实验和细胞划痕实验检测过表达ANGPTL2细胞克隆和干扰ANGPTL2细胞克隆的侵袭能力。结果：(1)慢病毒介导的RNA干扰和过表达克隆技术成功沉默和上调人结肠癌细胞株HCT-116和SW620中ANGPTL2的表达,并建立了稳定沉默和过表达ANGPTL2的细胞系。(2)感染ANGPTL2过表达慢病毒(Lv-ANGPTL2-shRNA)进入HCT-116和SW620细胞后,MTT增长曲线显示两种细胞株在24h、48h和72h的细胞增殖速度明显快于Lv-NC(空载体)组和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。感染ANGPTL2干扰慢病毒(Lv-ANGPTL2-shRNA)进入HCT-116和SW620细胞后,MTT增长曲线显示两种细胞株在24h、48h和72h的细胞增殖速度明显慢于Lv-NC组和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)过表达HCT-116/Lv-ANGPTL2细胞克隆、HCT-116/Lv-NC细胞克隆和对照HCT-116细胞的克隆形成率分别为78±2.65%、61.3士7.51%和62.3±6.03%；过表达SW620/Lv-ANGPTL2细胞克隆、SW620/Lv-NC细胞克隆和对照SW620细胞的克隆形成率分别为84.3±3.06%、67.3±8.50%和68.3±5.51%,差异具有统计学意义(P<0.05)。干扰HCT-116/Lv-ANGPTL2-shRNA细胞克隆、HCT-116/Lv-NC-shRNA细胞克隆和对照HCT-116细胞株的克隆形成率分别为38.3±3.79%、64.7±3.51%和63±4.58%；干扰SW620/Lv-ANGPTL2-shRNA细胞克隆、SW620/Lv-NC-shRNA细胞克隆和对照SW620细胞的克隆形成率分别为42.7±4.04%、64.3±5.03%和69.7±5.57%,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3) Transwell实验显示稳定感染过表达Lv-ANGPTL2的HCT-116细胞和SW620细胞侵袭能力明显高于稳定感染Lv-NC组和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。感染Lv-ANGPTL2-shRNA的HCT-116细胞株和SW620细胞株侵袭能力明显低于感染Lv-NC-shRNA和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)显示细胞划痕实验显示,相比Lv-NC组和空白组,稳定感染过表达Lv-ANGPTL2组的HCT-116细胞和SW620细胞到24h时,划痕的间距明显减小,到48h时候,间距几乎消失；稳定感染干扰Lv-ANGPTL2-shRNA组的HCT-116细胞和SW620细胞在24h和48h时,细胞划痕的间隙明显增大。结论：(1)慢病毒载体介导的ANGPTL2shRNA干扰序列和ANGPTL2cDNA过表达克隆序列对HCT-116和SW620细胞具有高转染效率,并可以沉默和上调ANGPTL2在HCT-116和SW620细胞中的表达。(2)MTT和克隆形成实验证明ANGPTL2促进了人结肠癌细胞株HCT-116和SW620细胞的增殖。(3)Transwell实验和细胞划痕实验结果证明ANGPTL2促进了人结肠癌细胞株HCT-116和SW620细胞的侵袭能力。第三部分MiRNA-25通过靶向ANGPTL2抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭目的：探讨miRNA-25对结肠癌细胞中ANGPTL2的调控作用以及对细胞增殖和侵袭能力的影响。方法：(1)通过生物信息学软件TargetScan,分析了人ANGPTL2基因mRNA的3’非翻译区,寻找潜在的miRNA-25结合位点。(2)通过real-time PCR和western blot检测在HCT-116和SW620细胞中过表达miRNA-25和转染miRNA-25抑制物后,细胞中ANGPTL2mRNA和蛋白水平的表达变化。(3)分别将野生型以及突变miRNA-25结合位点的ANGPTL2mRNA的3’非翻译区克隆进入报告基因载体psi-CHECK2,通过荧光素酶报告基因实验检测野生型报告基因载体ANGPTL2-3’UTR-psi-CHECK2和突变型报告基因载体Mut-ANGPTL2-3’UTR-psi-CHECK2的荧光素酶活性。(4)通过MTT和克隆形成实验检测过表达miRNA-25或miRNA-25抑制物对HCT-116和SW620细胞增殖的影响。(5)通过Transwell小室实验和细胞划痕实验检测过表达miRNA-25或miRNA-25抑制物对HCT-116和SW620细胞的侵袭能力的影响。结果：(1)通过生物信息学软件TargetScan,在人ANGPTL2基因mRNA的3’非翻译区发现了一个潜在的miRNA-25结合位点。(2)在HCT-116和SW620细胞中过表达miRNA-25,显著降低了细胞中的ANGPTL2mRNA和蛋白的表达水平；而分别转染miRNA-25抑制物进入HCT-116和SW620细胞明显上调了细胞中ANGPTL2mRNA和蛋白的表达水平。(3) miRNA-25能够显著抑制野生型报告基因载体ANGPTL2-3’UTR-psi-CHECK2的荧光素酶活性,而对突变型报告基因载体Mut-ANGPTL2-3’UTR-psi-CHECK2的荧光素酶活性没有影响。(4)相比转染pre-con和对照组,转染pre-miRNA-25后的72h之内,HCT-116和SW620细胞的增殖速度明显减慢。转染anti-miRNA-25及对照物进入HCT-116和SW620细胞后72小时之内,相比对照物组和空白对照组,anti-miRNA-25显著的促进了这两株人结肠癌细胞株的增殖能力。(5)在HCT-116细胞中,空白对照组、转染pre-con组和转染pre-miRNA-25形成的克隆数目分别为61.00±7.55、69.67±5.69和43.0±4.00；在SW620中,空白对照组、转染pre-con组和转染pre-miRNA-25形成的克隆数目分别为65.67±3.51、64.67±7.51和48.0±3.61,差异具有统计学意义(P<0.05)。在HCT-116细胞中,空白对照组、转染anti-con组和转染anti-miRNA-25形成的克隆数目分别为60.30±5.69、60.00±3.61和78.3±4.51；在SW620中,空白对照组、转染anti-con组和转染anti-miRNA-25形成的克隆数目分别为67.67±3.51、66.67±8.14和81.0±4.00,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6) Transwell实验显示转染pre-miRNA-25进入HCT-116细胞株和SW620细胞株后的细胞侵袭能力明显低于空白和转染对照miRNA的HCT-116或SW620细胞株,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染anti-miRNA-25进入HCT-116细胞株和SW620细胞株后的细胞侵袭能力明显高于空白和转染对照miRNA的HCT-116和SW620细胞株,差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)细胞划痕实验显示,相比空白对照和转染pre-con组,转染pre-miRNA-25的HCT-116细胞和SW620细胞在24h和48h时的划痕间距明显增大。相比空白对照和anti-con转染组,转染pre-miRNA-25的HCT-116细胞和SW620细胞在24和48h时的划痕间距明显缩小。结论：(1)MiRNA-25能够直接结合到ANGPTL2mRNA的3’非翻译区的miRNA-25结合位点负调控HCT-116和SW620细胞中ANGPTL2基因的表达。(2). MiRNA-25通过靶向负调控ANGPTL2的表达抑制人结肠癌细胞的增殖和侵袭能力,暗示miRNA-25/ANGPTL2途径可能成为诊断和治疗结肠癌的分子靶标之一。主要创新点：1.首次研究ANGPTL2在结肠癌组织和细胞中的表达及与临床病理特征的关系。2.首次探讨ANGPTL2对结肠癌细胞的增殖和侵袭的影响。3.首次发现miRNA-25能够直接结合到ANGPTL2mRNA的3’非翻译区的miRNA-25结合位点负调控ANGPTL2基因的表达。