对虾白斑综合征（White spot syndrome,WSS）是目前对虾养殖业所面临的分布最广且危害最大的病害之一,该病的病原体为白斑综合征病毒（White spotsyndrome virus,WSSV）。目前没有有效的药物治疗WSS,而且WSSV的扩散速度很快,因此迫切需要一种简便、快捷的WSSV检测技术,以期及早发现WSSV的感染,及时净化养殖水体,预防WSS的爆发,降低经济损失。金纳米颗粒具有优异的等离子共振效应、优良的生物相容性、表面易修饰等特性。目前利用金纳米颗粒制备金纳米探针,并结合暗场显微镜成像技术对目标检测物的位置和数量进行监测的检测方法已广泛应用于分子成像、生物检测等方面。本论文构建了一种特异性标记WSSV的金纳米探针,结合暗场显微镜技术,用于简便快速地检测样本中的WSSV。本研究包括以下几部分:（1）WSSV的增殖纯化及实时荧光定量PCR检测WSSV方法的建立:感染WSSV的克氏原螯虾（小龙虾）组织冰浴研磨液通过蔗糖密度梯度离心分离获得纯化的病毒,透射电子显微镜（TEM）观察发现其纯度高,病毒囊膜多破裂,只剩下核衣壳结构。根据WSSV的保守基因序列设计特异性引物,构建含WSSV目的基因的质粒作为标准品,建立了 WSSV实时荧光定量PCR标准曲线。标准曲线中Ct值与质粒拷贝数（X）的关系为Ct=-3.7168X+42.291（X为质粒拷贝数的对数）,相关系数R2=0.9991,表明标准曲线线性关系良好。通过建立的实时荧光定量PCR技术对纯化的WSSV进行定量检测,测得WSSV的DNA浓度为7.12×107 copies/μL。（2）抗WSSV VP664多克隆抗体的制备与鉴定:本研究将WSSV的核衣壳蛋白VP664基因的一段高度保守序列克隆到pET-28a（+）表达载体上,以E.coli BL21为宿主菌,成功表达并纯化了目的蛋白。随后将该重组蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,通过ELISA实验确定其血清效价为1:256000,血清纯化后经Western blot实验证明制备的多克隆抗体可以与WSSV特异性反应。（3）金纳米探针结合暗场显微镜检测WSSV方法的构建:1)金纳米探针的制备和表征:将制备的多克隆抗体与表面修饰protein A的金纳米颗粒（粒径为15 nm）共同孵育后纯化,制备成可特异性结合WSSV的金纳米探针。通过 SDS-PAGE、UV-Vis 吸收光谱、DLS（Dynamic light scattering）及 TEM 分析制备的探针,结果表明金纳米颗粒成功修饰上了抗体且单分散性良好,每个纳米颗粒表面可以结合约50个抗体分子。2)金纳米探针辅助暗场显微镜检测WSSV:用纯化的WSSV验证金纳米探针结合暗场显微镜的快检方法。金纳米探针与纯化的WSSV孵育后,在暗场显微镜下可以清晰的观察到明亮的金黄色椭圆型结构,而单独的金纳米探针和WSSV在暗场下不可见。TEM观察发现金黄色结构是由于上百个金纳米探针结合于WSSV的核衣壳表面形成的。该计数方法的结果与实时荧光定量PCR检测结果高度吻合,检测限约为5.7×101 copies/μL,灵敏度比荧光定量PCR方法高10倍。最后,我们也检测了感染WSSV的螯虾组织样本,结果表明本研究构建的金纳米探针结合暗场显微镜定量检测WSSV实际样本的结果与荧光定量PCR结果相近。因此,本研究构建的金纳米探针-暗场显微镜检测WSSV方法,制备探针简单,检测快速,灵敏度也比常用的荧光定量PCR技术高10倍。综上所述,本文建立的金纳米探针结合暗场显微镜检测WSSV技术具有操作简便、检测时间短（只需要将虾体组织匀浆上清与探针孵育30分钟后通过暗场拍照并用软件自动计数）和灵敏度高的优势,为WSSV的超灵敏快速检测提供了一种新的技术,有望服务于基层养殖单位。