铁是机体含量最丰富的金属元素之一，含铁蛋白在体内发挥重要的生理功能，参与氧的转运，细胞呼吸、物质代谢、转录调节和DNA修复。机体铁缺乏会产生缺铁性贫血和多种代谢障碍，然而过量的铁在体内能通过Fenton反应引起脂质过氧化，进一步损伤蛋白质和（或）核酸。机体铁负荷与癌症、冠心病、帕金森病、糖尿病等多种疾病的发生有关。肝脏是机体储存铁的主要器官，也是铁过量损伤的主要器官，有大量研究资料证实，肝铁过负荷会导致肝细胞坏死，纤维化和肝肿瘤，还能引起胰岛素抵抗、增加胆固醇的合成和沉积。因此探讨铁过负荷的原因，寻找防治的潜在靶点成为医学研究的热点。目前已证实HFE、HJV、TfR2等基因突变导致遗传性血色素沉着病，反复输血、膳食铁摄入过多等因素都可以引起机体铁过负荷，但是对于大多数疾病存在铁过负荷的原因尚未完全阐明。心理应激是指机体对外界有害物、威胁、挑战经认识评价后，知其将危害个人的生存和地位时，所产生的生理、心理和行为反应。现代生活中，人们在工作和生活中承受的负荷越来越大，精神紧张和心理压力已成为重要的应激源，心理因素对人体健康的影响正引起研究者广泛的关注。课题组前期的研究发现，心理应激可引起实验动物肝铁蓄积。其中部分原因可能是通过IL-6上调hepcidin及糖皮质激素对IRP1的调节，由于心理应激动物肝铁蓄积十分明显，是否还有其它的因素导致肝铁蓄积有待于进一步研究。为了深入分析心理应激导致肝铁蓄积的可能原因，本研究采用基因芯片技术筛选心理应激大鼠肝脏的差异表达基因，并根据基因表达趋势分析与肝铁负荷变化趋势相一致的基因，寻找与肝铁代谢变化有关的分子。结果发现在心理应激情况下，hepcidin、TfR1等已知的与铁代谢有关的分子发生了变化，还发现SFXN1的表达增强。SFXN1也称为三羧基携带蛋白TCC，是sideroflexin家族成员之一，定位于线粒体膜上，是真核生物的一种进化保守蛋白。有研究资料表明，SFXN1可能具有转运有利于铁利用的某种成分进入线粒体的功能，flexed-tail小鼠SFXN1发生了移码突变，表现出红细胞线粒体内铁沉积的特征。线粒体是细胞电子传递和能量代谢最为旺盛的细胞器，线粒体内铁代谢紊乱会严重地影响到整个细胞的铁代谢。因此，SFXN1是否对细胞铁代谢相关分子产生一定的影响，从而参与心理应激反应肝铁负荷的发生，我们进行了进一步实验研究。研究目的利用基因芯片筛选心理应激情况下大鼠肝脏的差异表达基因，并在此基础上寻找可能参与心理应激铁代谢异常的基因，为阐明心理应激导致肝铁负荷提供新的研究思路。研究方法一、心理应激大鼠血清铁和肝铁含量变化1、实验动物分组健康雄性SD大鼠48只（体重120±10g），购自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司。按体重随机分为对照组、1天、3天、7天心理应激组4组，每组8只，其余作为电击组。自由饮食，动物实验室条件为：温度24℃士1℃，湿度50％～60％，光照自然昼夜节律变化。2、制作心理应激模型大鼠心理应激模型制作采用Communication box system。该装置由透明丙烯酸板制成，所有小室的一半铺绝缘板（A室），另一半不铺绝缘板（B室）。B室的大鼠每天足底电击30分钟，电压为80V，大鼠被电击后尖叫、跳跃、排便；相邻A室的大鼠通过听觉、视觉和嗅觉产生心理应激。3、血清CORT、ACTH及NE测定按检测试剂盒说明测定血清CORT、ACTH及NE的浓度。4、测定肝铁、血清铁含量湿法消化肝组织，原子吸收分光光度计火焰法测定肝铁和血清铁含量。5、血清转铁蛋白饱和度的测定采用血清铁和血清总铁结合力试剂盒测定。二、心理应激大鼠肝脏SFXN1及铁代谢相关分子的变化1、实验动物分组及处理第一部分的实验动物，每组随机抽取三只大鼠，选择肝组织进行基因芯片分析。2、基因芯片分析采用Affymetrix公司的Rat Exon1.0STArray全转录组表达谱芯片，利用随机方差模型（RVM），以P﹤0.05和FDR﹤0.05为判断标准，进行差异基因筛选。用GO分类法查找与铁代谢有关的基因，并根据基因表达趋势分析与肝铁负荷变化趋势相一致的基因。3、大鼠肝脏hepcidin、TfR1、sfxn1mRNA表达的变化采用实时荧光定量PCR法测定大鼠肝脏内铁调素(hepcidin)、转铁蛋白受体1（transferrin receptor1，TfR1）、sideroflexin1（sfxn1）的mRNA表达变化。4、测定大鼠肝组织hepcidin、TfR1、sfxn1蛋白含量免疫印记法测定各组大鼠肝脏hepcidin、TfR1、sfxn1的蛋白含量。三、 SFXN1对肝细胞铁代谢主要调节分子的影响1、细胞培养HepG2肝细胞株，含10%胎牛血清的DMEM培养液37℃、5%CO2培养。2、Sfxn1siRNA转染细胞按说明书将sfxn1siRNA转染HepG2细胞后，培养箱中培养48h。3、肝细胞sfxn1、TfR1、hepcidin、IRP1、IRP2mRNA测定采用实时荧光定量PCR法测定HepG2细胞sfxn1、TfR1、hepcidin、IRP1、IRP2mRNA的表达水平。4、肝细胞sfxn1、TfR1、hepcidin、IRP1、IRP2的蛋白测定采用Western blot法测定HepG2细胞sfxn1、TfR1、hepcidin、IRP1、IRP2的蛋白含量。四、数据的统计与处理采用SPSS16.0统计软件包对实验数据进行统计分析。两组间比较采用两独立样本t-检验；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时各组样本均数间两两比较采用LSD-t检验，各实验组间与对照组比较采用Dunnett法。方差不齐时采用Dunnett’s C检验。实验数据以平均数±标准差（x±s）表示，p<0.05认为有统计学意义。结果一、心理应激大鼠血清铁和肝铁含量变化1、心理应激大鼠血清CORT、ACTH与NE含量变化心理应激大鼠血清CORT、ACTH、NE含量较对照组明显升高，说明心理应激模型成功制作。2、心理应激大鼠肝脏铁含量变化随着应激时间的延长，大鼠肝组织铁含量逐渐升高，7天心理应激组大鼠肝脏铁含量与对照组比较上升了53.02%（P<0.05）。1天和3天心理应激组大鼠肝铁含量与对照组比较无统计学意义（P>0.05）。3、心理应激大鼠血清铁含量变化1天和3天心理应激组大鼠血清铁含量与对照组比较无统计学意义（P>0.05）,与对照组比较，7天心理应激组大鼠血清铁含量下降了29.21%，差异有统计学意义（P<0.05）。4、心理应激大鼠血清转铁蛋白饱和度的变化与对照组比较，7天心理应激组大鼠血清转铁蛋白饱和度下降了32.2%（P<0.05）；1天和3天心理应激组大鼠血清转铁蛋白饱和度较对照组分别下降了7.87%、19.85%，但无统计学意义（P>0.05）。二、心理应激大鼠肝脏SFXN1及铁代谢相关分子的变化1、基因芯片筛选心理应激大鼠肝脏铁代谢相关差异基因在心理应激过程中，大鼠肝脏基因mRNA转录水平有明显差异的为2246个。对这些差异表达基因进行生物信息学分析，与铁代谢有关的差异基因有七个，分别为Hamp、Tfrc、sfxn1、GDF2、IREB2、NUBP1、NUBP2。sfxn1基因的表达趋势分析显示其变化趋势与肝铁沉积变化趋势一致。2、心理应激大鼠肝脏hepcidin、TfR1mRNA的表达变化7天心理应激后大鼠肝脏hepcidin mRNA的表达水平较对照、1天、3天心理应激组均有显著升高（P<0.01）；心理应激第七天TfR1mRNA的表达水平比对照、1天、3天心理应激组升高，并有统计学意义。3、心理应激大鼠肝脏hepcidin、TfR1的蛋白表达变化7天心理应激组hepcidin蛋白的表达水平较对照、1天、3天心理应激组均有显著升高（P<0.01）。TfR1蛋白在应激后逐渐升高，7天心理应激组TfR1蛋白的表达水平与对照组比较有统计学意义（P<0.01）。4、心理应激大鼠肝脏sfxn1的表达变化应激后sfxn1mRNA的水平逐渐升高，3天应激组与对照组、1天应激组比较有统计学意义（P<0.01）；7天应激组sfxn1mRNA的表达水平比对照、1天、3天心理应激组升高，并有统计学意义（P<0.01）。Sfxn1蛋白在应激后逐渐升高，7天心理应激组的表达水平较对照组升高66%（P<0.01）。三、SFXN1对肝细胞铁代谢主要调节分子的影响1、Sfxn1siRNA转染对HepG2细胞sfxn1mRNA表达的影响HepG2细胞转染sfxn1siRNA后sfxn1mRNA的表达量较未转染的对照组降低（P<0.05）。2、Sfxn1siRNA转染对HepG2细胞TfR1、 hepcidin mRNA表达的影响Sfxn1siRNA转染HepG2细胞48小时后，转染组TfR1mRNA的表达量较未转染组降低了78%（P<0.01）。Hepcidin mRNA的表达量与对照组比较无区别。3、Sfxn1siRNA转染对HepG2细胞IRP1、 IRP2mRNA表达的影响Sfxn1siRNA转染HepG2细胞48小时后，转染组IRP1mRNA的表达量较未转染组降低了80%（P<0.05）。转染组IRP2mRNA的表达量与对照组比较无差别。4、Sfxn1siRNA转染降低HepG2细胞sfxn1蛋白表达Sfxn1siRNA转染HepG2细胞后使sfxn1蛋白表达下降（P<0.01）。5、Sfxn1siRNA干扰对HepG2细胞TfR1、 hepcidin蛋白表达的影响Sfxn1siRNA转染HepG2细胞后使TfR1蛋白表达下降（P<0.01）。hepcidin的蛋白表达不受影响。6、Sfxn1siRNA干扰对HepG2细胞IRP1、 IRP2蛋白表达的影响Sfxn1siRNA转染HepG2细胞后使IRP1蛋白表达下降（P<0.01）。IRP2的表达未发生改变。结论1.连续7天心理应激可以引起大鼠肝铁蓄积。2.基因芯片发现心理应激过程中Hamp、Tfrc、sfxn1、GDF2、IREB2、NUBP1、NUBP2共7个与铁代谢相关的基因发生了改变。hepcidin、TfR1、sfxn1的mRNA和蛋白水平随着应激天数的增加不断上升。3. sfxn1能影响TfR1的表达综上所述，心理应激时可能通过sfxn1引起转铁蛋白受体1表达增加，肝细胞摄入铁增加，导致肝铁蓄积。