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目的：研究BEZ235通过PI3K/Akt信号通路体外抑制肝癌细胞的作用及分子机制,为肝癌的生物学治疗提供可能的分子靶点及抑制剂；同时研究Six1蛋白表达检测在肝癌生物学行为判定中的临床病理学意义。材料与方法：体外培养肝癌HepG2细胞,首先应用MTT法检测PI3K/AKT的选择性抑制剂BEZ235对HepG2细胞的抑制作用,并应用倒置显微镜观察加药前后(0h、48h) HepG2细胞的形态学变化；其次,利用Western blotting方法、免疫荧光法检测BEZ235处理前后迁移相关因子Ezrin蛋白的表达情况以及血管生成相关因子Six1、VEGF、HIF等蛋白的表达定位情况。此外,利用流式细胞仪、Hoechst33324染色法,检测BEZ235处理前后细胞的凋亡情况。并利用划痕、平板克隆形成等验证BEZ235处理前后HepG2细胞的增殖、迁移以及凋亡情况。另外,应用免疫组化方法检测了Six1蛋白在162例肝癌、87例癌旁正常肝组织以及35例正常肝组织中的表达,并分析了其临床检测意义。结果：1. BEZ235可抑制肝癌HepG2细胞中的PI3K/Akt信号通路。应用梯度浓度BEZ235处理HepG2细胞48小时后发现：与未处理组比较,p-Akt在50nM处理组开始表达下降,并呈现浓度依赖现象,提示BEZ235可以抑制HepG2细胞中的PI3K/Akt信号通路。2. BEZ235可抑制HepG2细胞的增殖。倒置显微镜观察发现,未经处理的HepG2细胞体外生长连接紧密,有明显的极性；而应用BEZ235处理组的HepG2细胞呈扁梭形、细胞间连接松散。MTT检测结果表明,BEZ235可浓度依赖性地抑制HepG2细胞的体外增殖,100nM BEZ235处理组可体外杀伤约50%的HepG2细胞；平板克隆实验也证明：随着BEZ235药物处理浓度的升高,HepG2细胞体外克隆形成率逐渐降低；Western blotting实验结果则表明,BEZ235体外抑制HepG2细胞的增殖主要是通过下调增殖相关因子Skp2蛋白的表达而实现的。3.BEZ235可抑制HepG2细胞的迁移和浸润。划痕实验结果表明：与未给药的对照组相比,BEZ235药物处理24h、48h后,HepG2细胞的迁移能力明显受到抑制。Western blotting结果证明：转移相关因子Ezrin和磷酸化Ezrin (p-Ezrin)的表达量呈浓度依赖性下降,而且其上游的Sixl蛋白表达水平也呈明显的浓度依赖性下降；此外,免疫荧光实验也证实：BEZ235可抑制HepG2细胞中Ezrin及其上游Sixl蛋白的表达。4. BEZ235可诱导HepG2细胞凋亡。流式细胞仪检测结果表明：PE-Annexin-V/7AAD染色后,经BEZ235处理的HepG2细胞凋亡比例由2.98%升高至12.84%。此外,Hoechst33342染色可以看出,未经药物处理的细胞,核膜完整,细胞核呈蓝色。而经BEZ235药物处理48h后,细胞核呈亮蓝色、碎片状边集呈分叶状。Western blotting结果显示,经BEZ235处理后,Caspase-3、Caspase-9以及PARP出现裂解条带。说明BEZ235可通过Caspase-3、Caspase-9以及PARP体外诱导HepG2细胞的凋亡。5. BEZ235可通过Six1、VEGF.HIF等体外抑制HepG2细胞的血管生成。Western blotting结果显示,血管生成相关因子Six1、VEGF、HIF蛋白的表达量随着药物浓度的升高而降低；免疫荧光结果与其结果一致。6. Six1蛋白过表达提示肝癌患者的不良预后。免疫组化结果显示：与正常肝组织及癌旁正常肝组织相比,Six1蛋白在肝癌组织中表达明显增强,且Six1蛋白过表达与肝癌不良预后明显相关,即Six1蛋白表达与肿瘤大小、临床分期及静脉浸润有密切关系。单因素及多因素分析结果表明,Six1蛋白过表达可以作为肝癌预后判定的独立风险因子。结论：BEZ235可有效抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移及浸润、血管形成及凋亡;Six1在肝癌发生发展过程中起重要作用,其蛋白过表达提示肝癌患者的不良预后,并有望成为肝癌的独立风险预测指标。