【摘 要】
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研究目的:检测分泌性PKG II对VEGFR2、PDGFRβ和c-Met诱导的胃癌细胞迁移、侵袭和增殖的作用,明确分泌性PKG II对三种受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases,RTKs）及其介导的信号通路活化的影响,阐明分泌性PKG II阻断三种RTKs活化的分子机制。研究方法:（1）采用重组蛋白PKG II作用于胃癌细胞株HGC-27和AGS,并以8-p CPTc
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研究目的:检测分泌性PKG II对VEGFR2、PDGFRβ和c-Met诱导的胃癌细胞迁移、侵袭和增殖的作用,明确分泌性PKG II对三种受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases,RTKs）及其介导的信号通路活化的影响,阐明分泌性PKG II阻断三种RTKs活化的分子机制。研究方法:（1）采用重组蛋白PKG II作用于胃癌细胞株HGC-27和AGS,并以8-p CPTc GMP特异性激活重组蛋白PKG II,再加入VEGF-A、PDGF-BB或HGF,采用Transwell迁移实验检测细胞的迁移活动;采用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭活动;采用CCK8检测细胞的增殖活动。（2）采用Western blotting检测活化的重组蛋白PKG II对VEGFR2、PDGFRβ和c-Met及下游MAPK/ERK和PI3K/Akt通路中信号分子的活化作用。（3）采用Co-IP与Western blotting方法检测胃癌细胞中重组蛋白PKG II与三种RTKs的相互结合;采用IP与Western blotting方法检测胃癌细胞中重组蛋白PKG II对三种RTKs的丝/苏氨酸磷酸化的作用。（4）建立蛋白激酶体外反应体系,采用pull-down和Western blotting方法检测重组蛋白PKG II与三种RTKs胞外段重组蛋白的相互结合;采用Western blotting检测重组蛋白PKG II对三种RTKs胞外段重组蛋白的丝/苏氨酸磷酸化的作用。（5）采用蛋白激酶磷酸化位点预测软件GPS 3.0预测分泌性PKG II对三种RTKs胞外段的潜在作用位点;采用定点突变的方法构建相应的突变体质粒;突变体质粒转染COS-7细胞后,采用IP与Western blotting方法检测重组蛋白PKG II对三种RTK突变体的丝/苏氨酸和酪氨酸磷酸化作用。研究结果:（1）在胃癌细胞中,活化的重组蛋白PKG II可抑制VEGFR2、PDGFRβ和cMet三种RTKs诱导的迁移、侵袭和增殖活动。（2）活化的重组蛋白PKG II可抑制三种RTKs及下游MAPK/ERK和PI3K/Akt通路的激活。（3）重组蛋白PKG II可与VEGFR2发生结合,活化的重组蛋白PKG II可使VEGFR2发生丝/苏氨酸磷酸化,S319和T439位点是重组蛋白PKG II磷酸化VEGFR2的特异性位点。（4）重组蛋白PKG II可与PDGFRβ发生结合,活化的重组蛋白PKG II可使PDGFRβ发生丝/苏氨酸磷酸化,S254位点是重组蛋白PKG II磷酸化PDGFRβ的特异性位点。（5）重组蛋白PKG II可与c-Met发生结合,活化的重组蛋白PKG II可使c-Met发生丝/苏氨酸磷酸化,S905位点是重组蛋白PKG II磷酸化c-Met的特异性位点。结论:重组蛋白PKG II可与VEGFR2、PDGFRβ和c-Met相互结合,使VEGFR2、PDGFRβ和c-Met丝/苏氨酸磷酸化,阻断三种RTKs的激活,抑制由其介导的信号通路,进而抑制三种RTKs诱导的细胞迁移、侵袭和增殖活动,提示PKG II作为分泌性蛋白激酶,可通过作用于膜表面的靶点而发挥抑制肿瘤发生发展的作用,是潜在的肿瘤抑制因子。
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