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研究背景和目的耳聋-肌张力障碍-视神经病(Deafness-Dystonia-Optic Neuronopathy,DDON)综合征,是一种X连锁隐性遗传病,主要的临床特征是感音性听力损伤、肌张力障碍和视神经萎缩。其致病基因为DDP1(deafness dystonia peptide 1)/TIMM8A(translocase of inner mitochondrial membrane 8A),编码产物为DDP1 蛋白。DDP1与酵母细胞Tim8同源,是高度保守的线粒体膜间隙(mitochondrial intermembrane space,IMS)蛋白。DDP1 与Tim13形成DDP1-Tim13复合体,可能协助了Tim23等线粒体膜蛋白前体的转运。已知DDP1-Tim13复合体的底物包括了柠檬素和arala1,两者均参与了苹果酸-天冬氨酸NADH的穿梭途径。此外,DDP1含量的改变诱导线粒体形态发生变化。然而,DDP1的生物学功能尚不明确,且其生物学功能研究仅限于体外细胞的研究,尚无DDP1基因敲除动物模型。前期研究中,我们构建了携带Timm8a1基因变异(p.123fs49X)的小鼠模型,该基因鼠行为学发生改变,再现了DDON综合征患者的部分临床表型。为进一步阐明DDP1的生物学功能,本研究利用该小鼠模型,在体内验证Timm8a1基因变异对线粒体形态及线粒体功能的影响,并在体外验证不同变异体DDP1蛋白的亚细胞定位是否发生改变。研究方法1.Western Blot检测小鼠组织Tim8a含量的表达;2.苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察小鼠组织形态学;3.透射电子显微镜观察小鼠不同脑区及股四头肌的线粒体结构;4.WB检测Timm8a123fs49X/y突变小鼠各组织线粒体内呼吸链复合体及常见线粒体蛋白的转运是否发生改变;5.肌肉活检组织酶学染色观察线粒体呼吸链酶活性有无异常;6.构建携带不同变异体DDP1的质粒并转染至293T细胞内,观察DDP1的亚细胞定位是否发生改变。7.统计学方法本研究采用SPSS20.0进行数据分析,采用两独立样本t检验,P<0.05有统计学意义。研究结果1.突变小鼠各组织Tim8a蛋白缺失;2.突变小鼠各组织形态学正常;3.Tim8a缺失导致小鼠各脑区及股四头肌的线粒体超微结构出现异常,其中初级听觉皮层最为明显;4.Timm8a1基因突变不影响线粒体蛋白Tim23,Tom40和SOD-2的转运;5.Tim8a缺失不影响线粒体呼吸链复合体的含量及股四头肌的酶活性;6.C66W变异的DDP1亚细胞定位不变,位于线粒体内;而截短变异的DDP1亚细胞定位发生改变,弥散分布于整个细胞。结论1.Tim8a功能缺失导致线粒体的超微结构出现异常,但不影响Tim23、Tom40及SOD-2的转运,也不影响呼吸链复合体的生物学合成及酶活性。2.C66W变异的DDP1可转运至线粒体内,而截短变异的DDP1的亚细胞定位发生了改变,表明两种变异的致病机制可能不同。