论文部分内容阅读
目的我们监测到约20%的ALG13基因敲除小鼠(ALG13-/-)在出生后8周左右会表现出自发性癫痫,但是ALG13缺失导致癫痫发生的机制是不清楚的。方法1.利用同步化视频脑电系统连续监测WT和ALG13KO小鼠的行为学表现及皮层脑电14天;2.制备小鼠脑片,利用全细胞膜片钳技术记录颞叶第2/3层锥体神经元的微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）、微小抑制性突触后电流（mIPSCs）、0.5mM的士宁（甘氨酸受体阻滞剂）干预下的mIPSCs、0.3mM地西泮干预下的mIPSCs;3.分别给予同一组WT和ALG13KO小鼠腹腔注射地西泮（2mg/kg）、地西泮（0.25mg/kg）、生理盐水,每个治疗组连续注射3天,各组注射时间间隔1周,注射后连续监测小鼠EEG 24小时。4.利用免疫印迹法检测小鼠皮质中GABAARa1、GABAARa2、GABAARa5、GABAARg2的总蛋白和膜蛋白的表达变化;5.利用免疫荧光法检测ALG13与GABAARa2的细胞定位;6.利用RT-qPCR检测小鼠皮质中Gabra1、Gabra2、Gabra5、Gabrg2的mRNA表达变化。结果1.约20%的ALG13KO小鼠在出生后8周会出现频繁的自发性癫痫发作,具有典型癫痫发作的行为学表现（i.动作停滞;ii.阵挛,限于前肢,有时为单侧,接着颈部和尾巴出现张力亢进;iii.跳跃奔跑）和EEG改变（发作前期是低幅高频的电活动,后期是高幅低频的多重棘波）;所有的ALG13KO组小鼠均有“EEG癫痫发作”,而野生型小鼠则没有;相较于野生型小鼠,ALG13KO小鼠EEGd和q波功率均显著升高（P<0.001）。2.膜片钳结果显示ALG13缺失降低了GABAAR介导电流的振幅（P<0.001）,对mIPSC频率的影响则无显著差异;对甘氨酸受体介导电流的影响无显著差异;对mEPSC的振幅及频率的影响均无显著差异;0.3mM地西泮增加了的GABAAR介导电流的幅度（P<0.001）。3.2mg/kg和0.25mg/kg的地西泮（GABAAR正向别构调节剂）均显著降低了ALG13KO小鼠“EEG癫痫发作”的次数和EEGδ和θ波的功率（P<0.001）;而对于野生型小鼠,2mg/kg的地西泮降低了EEGδ和θ波的功率（P<0.01）,0.25mg/kg的地西泮则对δ和θ波的功率无显著影响。4.免疫印迹结果显示相较于野生型小鼠,ALG13KO小鼠GABAARa2总蛋白及膜蛋白表达均减少（P<0.001）,而GABAARa1、GABAARa5、GABAARg2总蛋白和膜蛋白的表达则无显著差异。5.免疫荧光结果显示ALG13在神经元上表达,且与GABAARa2共表达。6.RT-qPCR结果显示相较于野生型小鼠,ALG13KO小鼠的Gabra2 mRNA显著降低（P<0.001）,Gabra1、Gabra5及Gabrg2 mRNA则无显著差异。结论1.ALG13缺失可引起小鼠自发性癫痫发作;2.ALG13可能通过影响GABAAR介导的抑制性突触后电流改变神经元的兴奋性;3.ALG13可能通过与GABAARa2相互作用调节GABAA受体功能,进而参与癫痫的发生。