碳源的选择和利用始终是利用代谢工程技术进行生物合成的基本问题。如何高效利用碳源直接影响着产物的产量及生产的成本。然而,在过去的研究中,人们更多地通过提高关键酶的酶活或是引入更高效的生产途径来实现产物的高效生产,往往忽略了最基本的碳源代谢问题。这导致了大量的碳源被微生物消耗在了生物量的提高上,而非产物的合成途径。虽然也有研究曾通过碳源共利用等方法尝试解决碳源高效利用问题,但都没有从根本上找出碳源利用之间的关系,使得碳源的转化效率依旧不高。因此,为了从根本上解决碳源利用的问题,本文根据大肠杆菌中的碳源代谢利用特点,从以下四个方面进行了研究:1)构建了葡萄糖和甘油的协同利用平台;2)引入海藻糖生物合成模型验证葡萄糖和甘油的协同利用平台菌株,并实现了海藻糖的高效生产;3)利用木质纤维素水解液中的木糖作为单一碳源,尝试实现从五碳糖到六碳糖化合物的生物转化;4)利用木质纤维素水解液中的葡萄糖和木糖作为碳源,构建葡萄糖和木糖的协同利用平台菌株,并成功地应用到海藻糖的生物合成中。首先,’为了实现葡萄糖高效地转化为糖类化合物,我们构建了葡萄糖的非代谢利用途径,同时引入甘油作为第二碳源支持菌体生长,在葡萄糖和甘油的混合培养基中,成功地避免了葡萄糖效应对甘油利用的抑制。随后为了将两种碳源的代谢途径联系起来,我们调整了磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸的反应途径,使磷酸烯醇式丙酮酸只通过磷酸转移酶系统生成丙酮酸,这样使葡萄糖的转运和甘油的代谢偶联起来,从而建立了碳源的协同利用机制。但由于葡萄糖的下游途径缺乏,导致葡萄糖的消耗并不明显,因此没有看到这一机制的明显优势。随后,为了验证上述构建的葡萄糖和甘油协同利用平台菌株,我们引入了葡萄糖的下游利用途径,即海藻糖合成途径,进一步观察碳源的利用情况。首先,我们构建了海藻糖的生物合成模型,然后利用该模型验证上述平台菌株。然后我们进一步强化碳源协同利用机制,同时阻断了葡萄糖的竞争途径,成功地实现了海藻糖的高产,即在摇瓶培养基中得到了 8.2 g/L的海藻糖,且葡萄糖的转化效率达到了 0.86g海藻糖/g葡萄糖,占理论转化率的91%,同时甘油的利用效率也达到了 0.53 g海藻糖/g甘油,这一结果既验证了葡萄糖和甘油的协同利用平台,又为海藻糖的生物合成提供了新了思路。随着上一步碳源协同利用平台的成功实现,我们尝试从木质纤维素水解液入手进行碳源高效利用的研究。在木质纤维素水解液中,木糖作为含量较多的一种五碳糖,并未报道过其向六碳糖类化合物转化的研究,因此我们首次尝试通过五碳糖木糖直接参与合成六碳糖类化合物海藻糖。为了使木糖可以在支持菌体生长的情况下,更多地流向海藻糖的合成途径,我们阻断了糖酵解途径中果糖-6-磷酸的竞争途径,使果糖-6-磷酸生成葡萄糖-6-磷酸,从而参与到海藻糖的合成途径中。从最终的结果上看,虽然海藻糖的产量只有1 g/L左右,但五碳糖向六碳糖类化合物转化的尝试为五碳糖的应用提供了新的研究思路,同时也为我们进一步研究木质纤维素水解液的利用提供了新的方向。因此我们在接下来的研究中利用纤维素水解液中的葡萄糖和木糖作为碳源,根据上述提出的碳源协同利用平台机制,构建了葡萄糖和木糖的协同利用平台菌株。这一协同利用平台菌株是利用葡萄糖作为生产底物,木糖作为第二碳源来支持葡萄糖的转运和菌体的生长。同时依旧引入海藻糖的合成模型来验证这一协同利用平台。通过对协同利用机制的加强以及对海藻糖合成途径的优化,我们成功地在摇瓶中得到了 5.5 g/L的海藻糖。此外,葡萄糖和木糖的利用效率也比对照菌株增长率4倍。由此看出,葡萄糖和木糖的协同利用平台不但为海藻糖的合成提供了新的方法,同时也为木质纤维素水解液的高效利用提供了新的策略。总之,新的碳源利用平台的尝试与构建,成功地为碳源的高效利用开辟了新的研究路径,同时也为海藻糖等糖类化合物的生物合成提供了新的方法,更为生物合成的低成本工业化生产奠定了基础。