【摘 要】
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非典型蛋白质分泌作为经典蛋白质分泌途径的有益补充,在细胞的生命活动与功能中有着重要的生物学功能与意义。但非典型蛋白质分泌途径的生物发生与分子作用机制都尚未研究清楚。烟草花粉果胶甲酯酶（Nicotina tabacum pollen pectin methylesterase 1,Nt PPME1）是一种调控细胞壁合成的关键酶,它参与一条非典型的蛋白质分泌胞吐途径,首先,它在内质网中合成,在高尔基体
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非典型蛋白质分泌作为经典蛋白质分泌途径的有益补充,在细胞的生命活动与功能中有着重要的生物学功能与意义。但非典型蛋白质分泌途径的生物发生与分子作用机制都尚未研究清楚。烟草花粉果胶甲酯酶（Nicotina tabacum pollen pectin methylesterase 1,Nt PPME1）是一种调控细胞壁合成的关键酶,它参与一条非典型的蛋白质分泌胞吐途径,首先,它在内质网中合成,在高尔基体中进行修饰和分选,直接通过高尔基体衍生分泌囊泡被转送至质外体,但其中的分子作用与分选机制尚不清楚。本研究中,我们首先利用生物信息学预测Nt PPME1的结构,包括其二级结构和三级结构,以及潜在的糖基化位点,基于这些信息来深入研究Nt PPME1的分选运输信号与调控网络。通过蛋白质截断和点突变的方法,与荧光蛋白相融合,进行表达并研究其亚细胞定位与胞吐外泌过程。我们发现Nt PPME1的一些功能结构域可以影响非典型胞吐外泌:（1）Nt PPME1的极性胞吐外泌过程中,需要Pro region结构域和PME结构域的同时存在,任何一个结构域的缺失都会抑制其靶向外泌过程。（2）Nt PPME1的无规则卷曲序列包含内质网输出信号,同时在PME结构域中的20个氨基酸中包含一段可帮助蛋白质运输至顺式高尔基体的功能序列,缺少该段序列将导致蛋白驻留在内质网当中,进一步点突变证明FV和LL这四个氨基酸在其中发挥关键的作用。（3）Nt PPME1的羧基端序列是其运输到质外体的关键;位于Nt PPME1羧基端的5个氨基酸对于蛋白质运输到膜外非常重要,缺少这5个氨基酸后,蛋白质被留在胞内,进一步点突变证明EAGMM整个的功能序列在这个过程中均发挥重要作用,单点突变任何一个氨基酸均不会影响蛋白质的正常运输。（4）第四个N-糖基化位点影响高尔基体衍生分泌囊泡与细胞膜的融合。在预测的四个糖基化位点中,第四个糖基化位点（N482）在蛋白质运输当中起着重要的作用,仅突变这一个氨基酸就会导致蛋白质的外泌过程被阻断,进一步与细胞内膜系统各细胞报告蛋白共定位后发现大部分蛋白质留在高尔基体直接分泌囊泡中。综上所述,在本研究中,通过对Nt PPME1进行截断突变和点突变并开展在细胞定位与运输过程的分析,我们找到了各种调控功能单元在蛋白质非典型胞吐外泌当中发挥不同的作用,为揭示非经典的蛋白质分泌途径的分子作用机制与生物发生过程,同时为人们深入探索和了解胞内非典型蛋白质分泌途径的生物学功能与作用机制提供了重要的理论基础。
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