多焦点结构光照明显微技术(multifocal structured illumination microscopy,MSIM)作为一种新的超分辨率荧光显微技术,不仅能够实现两倍于宽场的分辨率提升,而且具有较强的细胞组织穿透能力和层析成像能力,相比于传统的宽场结构光照明显微而言,更适合应用于厚样品的三维超分辨成像。另外,MSIM可以与大部分点扩散函数工程方法或多光子技术相结合,实现系统性能的提升。因此,该技术在生命科学的研究中具有巨大的应用潜力。但是,MSIM有限的空间分辨率和较慢的三维成像速度仍制约着其在活体细胞的纳米分辨动态成像中的应用。针对目前MSIM存在的一些问题,本论文首先通过超分辨图像重构算法的改进来进一步提高其空间分辨率;其次,通过结合多焦面显微和双螺旋点扩散函数工程改造其探测光路,提高其三维成像的时间分辨率并扩展其光谱成像的功能。主要工作包括:1)开展了稀疏贝叶斯学习的MSIM超分辨图像重构方法研究,搭建了MSIM系统并编写了数据处理程序,并通过生物样品实验分析了影响MSIM成像质量的因素。在此基础上,将基于多重测量矢量模型的稀疏贝叶斯学习算法(multiple measurement vector model sparse bayesian learning,MSBL)用于MSIM系统的超分辨图像重构,通过计算机模拟实验和生物样品成像实验证实了该方法能够实现90 nm的横向分辨率,是传统MSIM横向分辨率的1.5倍。2)将多值相位编码技术和传统变形光栅的设计方法相结合,提出了一种多值纯相位变形光栅(distorted multi-value purephase grating,DMVPPG)的设计方法,利用该方法设计的光栅能够将物体在不同轴向位置发射的光强信号均匀地分配到特定的衍射级上。计算机模拟成像实验表明:DMVPPG与透镜组构成的光学系统能够实现样品的多焦面成像,并保持图像强度之间的一致性。3)提出了具有光谱分辨的多焦面MSIM成像方法,并开展了相关成像原理和光谱、图像重构算法研究。在MSIM系统的探测光路中,引入基于DMVPPG的多焦面成像系统,并对MSIM图像重构程序进行相应修改,实现了多焦面的同时超分辨成像,提高了MSIM的三维成像速度;另外,利用光栅线性色散的特性,通过额外搭建的色散标定系统和数据处理程序,实现了MSIM的光谱探测和多色成像。最后,通过一系列成像实验,证实了新系统的成像能力。4)提出了基于双螺旋相位工程的MSIM(MSIM using helical phase engineering,MSIMH),并开展了相关成像原理和图像重构算法研究。在此基础上,设计了双螺旋点扩散函数相位片,并搭建了MSIMH超分辨成像系统;编写了系统控制和图像重构程序,实现成像区域的三维样品结构和深度信息的恢复;实验表明,MSIMH能够通过单次扫描获得2μm深度范围内的三维样品超分辨结构信息,相比MSIM,将三维成像所需要的扫描次数减少为原本的十分之一。本论文的创新点包括:1)提出利用MSBL压缩感知算法对MSIM系统获取的实验数据进行超分辨图像重构,简化了MSIM图像重构步骤,进一步提升了空间分辨率。2)提出了具有光谱分辨的多焦面MSIM成像方法,利用自行设计的多值纯相位变形光栅对MSIM的探测光路进行改造,实现了MSIM的多焦面超分辨成像和光谱探测。3)发展了基于双螺旋相位工程的MSIM,利用双螺旋点扩散函数相位片对MSIM系统的光学传递函数进行调制,实现轴向位置编码,通过DMD的二维快速数字扫描就可获得样品的三维信息,实现MSIM的三维快速超分辨体成像。