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牛轮状病毒(Bovine rotavirus)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)。是引起犊牛非细菌性腹泻的主要病原,牛轮状病毒主要感染15~40日龄的犊牛,以厌食、呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为特征性症状。如继发牛冠状病毒和细菌感染,则死亡率则高达80%,给养牛业造成很大经济损失。由于本病属于粪口途径传播的肠道传染性疾病。因此,设计疫苗以刺激肠道黏膜免疫,阻断病原入侵的第一道防线,对科学防治本病具有重要意义。本研究以干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393作为递呈抗原的活菌载体,利用牛轮状病毒主要免疫保护性抗原基因VP7主要中和位点为靶基因,定向插入到干酪乳杆菌表面表达和分泌型表达载体pPG-1、pPG-2,构建了pPG-1-VP7/L.casei393和pPG-2-VP7/L.casei393重组乳酸杆菌系统。以此作为口服制剂,通过乳酸杆菌表达和传递外源抗原以及乳酸杆菌本身黏附定植作用,有效刺激机体肠道黏膜免疫系统,达到预防牛轮状病毒病目的。实验从犊牛腹泻粪便中扩增获得了牛轮状病毒VP7全基因,序列测定结果显示,该病毒属G6血清型,属于牛轮状病毒感染的广泛流行株。实验首先使用大肠杆菌表达系统摸索并验证VP7基因在原核系统中表达的可能性及免疫效果。结果表明VP7蛋白第51~254位包含VP7蛋白主要抗原位点的基因片段得到了较好的表达。所制得的抗VP7蛋白小鼠抗血清具有较高的ELISA效价(1:6400)及中和抗体(1:316)效价。在此基础上,构建了表达牛轮状病毒VP7重组干酪乳杆菌表面表达系统了pPG-1-VP7/L.casei393和分泌型表达系统pPG-2-VP7/L.casei393。经乳糖诱导后,对菌体裂解物和培养上清进行的western blot检测表明,pPG-1-VP7/L.casei393在菌体裂解物中检测到了目的蛋白,而pPG-2-VP7/L.casei393表达系统在菌体裂解物和上清液中均检测到了目的蛋白的存在;间接免疫荧光试验证明,表达的牛轮状病毒VP7蛋白存在于菌体的表面。为进一步鉴定重组菌是否可诱导机体的系统和黏膜免疫应答,本实验将小鼠共分为3组,每组10只。口服免疫每只鼠2×109CFU活菌量,每隔14d免疫一次,免疫三次,每次连续免疫3d。免疫后于不同时间分别采集血清、粪便、外生殖道冲洗液样品,通过间接ELISA测定粪便、外生殖道冲洗液样品中特异性的sIgA和血清IgG水平,并通过细胞水平测定抗血清对病毒的中和效价,以评价其免疫保护作用。间接ELISA检测结果表明,口服免疫重组干酪乳杆菌后在小鼠粪便、外生殖道冲洗液均检测到了特异性sIgA,在小鼠血清中检测到了特异性的IgG。免疫重组菌后,小鼠外生殖道中sIgA于免疫后14d和37d、44d抗体水平达到峰值,和对照组相比,差异显著(P<0.05);小鼠粪便中sIgA在23d和44d抗体水平达到峰值,和对照组相比,差异显著(P<0.05);小鼠血清IgG水平在初次和再次免疫后未见抗体效价明显升高,三免后开始出现明显的上升趋势,免疫后的44d达到峰值(p<0.05),之后稍有回落。中和试验结果表明,pPG-1-VP7/L.casei393组与pPG-2-VP7/L.casei393组在免疫后48d血清的抗体中和效价分别为1:62.9和1:50.6。以上结果说明本研究所构建的重组干酪乳杆菌表达系统能够诱导机体产生局部黏膜免疫和系统免疫应答,并能诱导集体产生免疫保护作用。