研究背景弥漫性结缔组织病(connective tissue diseases,CTDs)是一类由自身免疫异常所致机体损伤的疾病总称,这类疾病几乎可累及到机体的每个器官,肺脏是最常受累的器官之一。其中,肺间质病变(Interstitial lung disease,ILD)是危害最大的并发症,可导致肺通气功能受损甚至呼吸功能衰竭,严重影响患者寿命,迄今为止,CTD-ILD的发病机制尚未完全阐明,缺乏根治性治疗方法。因此,本文拟通过研究新型药物吡非尼酮在体内及体外实验及临床治疗中的抗纤维作用,阐明ILD的部分发生机制及治疗对策,为肺间质病变治疗提供新的证据和思路。研究目的1.观察吡非尼酮治疗CTD-ILD的临床疗效和不良反应。2.了解吡非尼酮对博来霉素诱导肺纤维化小鼠的抗纤维化作用。3.阐明吡非尼酮对HLFs增殖、迁移侵袭、分泌功能和表型转化的影响及其机制。研究方法纳入确诊为CTD-ILD的患者,根据患者本人意愿用或不用吡非尼酮进行12个月治疗观察。在0月、3月、6月和12月时随访进行实验室检查、肺功能测试、6分钟步行距离和HRCT评分,吡非尼酮用药组(PFD)和对照组(CTR)间比较采用协方差分析,其中各组间不同时间点的比较采用重复测量数据的方差分析。8周龄雄性C57BL/6小鼠建立博来霉素诱导鼠肺纤维化模型,采用直视下气管内注射博来霉素或生理盐水,分别给予吡非尼酮或相应体积的溶剂灌胃治疗,均在第28天处死后取肺脏组织,随后进行H&E染色、Masson染色和组织免疫荧光染色观察肺组织病理改变和α-SMA、ATF3的表达。手术获取正常肺组织(经病理证实)进行分离原代人肺成纤维细胞(HLFs),CT引导下经皮肺穿刺活检获取CTD-ILD肺脏病变组织。MTT法检测细胞存活率,EdU法检测细胞的增殖能力,Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力,细胞免疫荧光检测α-SMA和ATF3,免疫印迹法检测α-SMA、ATF3和p-Smad3的蛋白水平,实时定量PCR检测α-SMA、ATF3和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达水平。应用慢病毒载体携带ATF3shRNA或对照shRNA感染体外培养的HLFs并进行验证。研究结果PFD组与CTR组相比,PFD组患者在第12月时FVC、TLC和DLco均得到显著改善(p值分别为0.044、0.017和0.001),而在第6月DLco明显增加(p值为0.033)。在随访期间与初始时间点相比,PFD组TLC在第3月即开始有明显改善,随后维持相同水平(p值分别为0.046、0.030和0.056),FVC和DLco在第6月开始有明显改善(p<0.05)。用吡非尼酮治疗3月后PFD组影像炎症评分均明显低于对照组(p值分别为0.021、0.010和0.036)。在随访期间PFD组炎症评分逐渐降低,而对照组则未观察到这种变化。吡非尼酮用药期间,患者最常出现的不良反应为乏力、呼吸困难、咳嗽、皮疹和消化不良,在临床对症处理下可减轻或消失。在博来霉素诱导小鼠肺间质纤维化模型中,预灌胃吡非尼酮可减少小鼠肺部结构破坏程度,降低胶原沉积,改善肺部纤维化。造模组小鼠肺组织中α-SMA的表达明显高于正常组和吡非尼酮干预组小鼠。CTD-ILD肺组织和造模组小鼠肺组织ATF3的表达明显高于正常组,然而吡非尼酮能降低ATF3在肺组织的表达。在TGF-β1诱导下HLFs的增殖、迁移侵袭能力和分泌功能能力显著增强,p-Smad3和ATF3的蛋白和mRNA表达水平明显高于对照组。吡非尼酮预处理HLFs能有效地抑制TGF-β1诱导的增殖、迁移侵袭能力、分泌功能和运动功能,下调p-Smad3和ATF3的蛋白和mRNA表达水平。ATF3敲低的HLFs其对TGF-β1刺激后的增殖、迁移侵袭能力和α-SMA和p-Smad3的蛋白水平均下降,其反应能力均明显弱于正常的HLFs。研究结论吡非尼酮能改善CTD-ILD患者肺功能结果和影像学评分,减少博来霉素肺纤维化鼠模型肺结构破坏、胶原沉积和纤维化程度,其治疗作用可能是通过抑制ATF3/Smad3通路从而减少HLFs表型转换来实现的。