背景:肝移植是当今公认的治疗终末期肝病的最有效的措施,作为世界上终末期肝病发病率最高的国家,在我国肝移植有很大的患者需求和应用前景。自1963年实施第一例肝移植以来,随着外科技术的日趋成熟,免疫抑制剂的应用,术后监护的完善,使得术后患者的生存率显著提高,生存时间明显延长,这也使得那些终末期肝病的患者迫切地希望通过肝移植来解决病痛。随着患者需求量不断增加,供肝匮乏成为阻碍我国肝移植开展的难题。为了解决供体器官短缺问题,DCD肝移植的提出和开展,在一定程度上的缓解了这一难题。肝移植排斥反应作为提高肝移植术后生存期的最大障碍,受到学者们的广泛关注,要使移植物长期存活,就必须给予有效的免疫抑制剂,抑制排斥反应。早期主要应用ALG,Aza,激素等免疫抑制剂。直到20世纪80代初,Cs A的出现和广泛应用,才使得移植效果发生了质的变化,目前国内外知名移植中心患者1年的生存率可达90%,大批患者可长期存活。即便如此,大多数肝移植受者(52%-82%)仍会发生排斥反应,并导致5%-10%的移植肝功能丧失。肝移植术后诱导免疫耐受和抗排斥反应仍是目前研究的热点问题。肝脏作为免疫特惠器官,通常在移植后发生排斥反应的概率和程度都远低于其它器官移植。这种现象表明,移植肝与宿主的免疫系统之间发生着一系列的相互作用,进而形成一种免疫耐受环境。在肝肾等多器官联合移植中,肝脏还可以诱导受体对其它器官的免疫耐受形成,从而保护受体其它器官稳定生存。如今,各大移植中心和研究机构都纷纷致力于肝脏天然免疫特性的研究,其机制可能与肝脏本身的解剖与生理特点,MHC-Ⅰ类分子,APC(如DC,巨噬细胞,KCs,活化的B淋巴细胞及T淋巴细胞),微嵌合现象,克隆清除以及40k Da的特殊蛋白有关。目的:通过对肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结、外周血的淋巴细胞表型和功能差异的分析,研究肝脏内免疫耐受的产生机制。方法:收集DCD肝移植供体的肝脏灌洗液,脾脏,肠系膜淋巴结,外周血,分离不同组织、器官的淋巴细胞(NK细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞)并提纯。再用PHA,OKT-CD3/CD28分别做体外刺激,培养,12小时候后分别做表面和细胞内染色。用FCM技术分析探讨不同组织、器官淋巴细胞的特异性表型和功能的差异,通过检测上述淋巴细胞的细胞内免疫抑制性细胞因子IL-10和炎性细胞因子IFN-γ的表达,探讨肝脏免疫耐受产生机制。结果:(1)相对于酶消化肝脏组织,机械匀质化肝脏组织这两种方法,用4℃的UW液灌洗离体肝脏的方法能更好更完整地保留肝内淋巴细胞的表型和功能。(2)肝内淋巴细胞中的NK和NKT细胞所呈现的表型频率明显高于脾脏、肠系膜淋巴结和外周血中的NK和NKT细胞。肝内淋巴细胞中的CD4+T细胞和脾脏中的CD4+T细胞呈现的表型频率明显低于肠系膜淋巴结和外周血中的CD4+T细胞。肝内淋巴细胞中的CD8+T细胞呈现的表型频率明显高于脾脏和肠系膜淋巴结中的CD8+T细胞;而与外周血中的CD8+T细胞相比并无显著差异。(3)NK细胞在肝脏和肠系膜淋巴结中表现出CD27分子的增高,而CD38、CD69分子的增高则体现在肝脏、脾脏和淋巴结中;与外周血相比,肝脏、脾脏和淋巴结中的CD62L分子的表达则表现出抑制状态。CD4+T淋巴细胞的检测显示:淋巴结中CD27和CD38的表达增高,而肝脏、脾脏和淋巴结的淋巴细胞CD69的表达增高;而与外周血相比,在肝脏、脾脏和淋巴结中CD62L的表达则降低。对于CD8+T细胞检测结果提示:在淋巴结中有一个升高的CD27和CD38表达,在脾脏和肝脏中CD38的表达升高,在除外周血之外三个器官中CD69的表达均升高;在淋巴结,脾脏和肝内淋巴细胞中CD62L的表达受抑制,而外周血中CD62L的表达则增高。(4)通过对肝脏内和外周血淋巴细胞中的NK、CD4+T和CD8+T细胞内的IL-10和IFN-γ表达进行检测后,我们发现肝脏淋巴细胞内IL-10的表达明显高于外周血淋巴细胞;而IFN-γ的表达则恰恰相反,肝内淋巴细胞明显低于外周血淋巴细胞。结论:(1)用4℃的UW保存液灌洗DCD肝移植离体肝脏,可获得表型和功能相对完整的肝脏淋巴细胞。(2)相对于脾脏、肠系膜淋巴结、外周血中的淋巴细胞,肝内淋巴细胞中NK细胞和NKT细胞数量的增多以及CD4+T细胞的减少,是肝内淋巴细胞的明显特征。(3)肝脏内淋巴细胞具有较强的免疫活性,细胞的分泌功能较强而迁移性较弱;而外周血的淋巴细胞具有较强的迁移功能,细胞的分泌功能较弱。肠系膜淋巴结中的淋巴细胞表现出强大的促进淋巴细胞活化以及增强淋巴细胞杀伤功能的活性。(4)肝内淋巴细胞相对于外周血淋巴细胞IL-10的表达明显增高,而IFN-γ的表达显著降低。相对于其它器官移植而言,这可能是移植后的肝脏更易形成免疫耐受的因素之一。