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乳腺是一个动态发育器官,是哺乳动物中唯一一个在出生后可以继续发育的特殊分泌腺体。在出生后,奶牛乳腺组织经历青春期、妊娠期、泌乳期和干奶期四个不同阶段。在不同时期,其特定形态结构以及生理功能受到精准调控。其中,激素水平调控承担着至关重要的角色。在妊娠期,由垂体前叶催乳激素细胞合成的催乳素（Prolactin,PRL）参与乳腺上皮细胞的增殖、导管延伸及分支和腺泡腔结构形成,在泌乳期,PRL能够启动及维持泌乳过程,提高乳汁中乳蛋白含量提高乳产量。核因子κB受体活化因子配体（Receptor activator of the NF-κB ligand,RANKL）是破骨细胞分化因子,能参与调控破骨细胞分化成熟,骨重塑以及骨平衡过程。在乳腺组织发育过程中,RANKL参与乳腺导管及腺泡腔结构的形成。在妊娠期小鼠乳腺组织中,RANKL是PRL调控乳腺组织发育关键下游调控因子。但是在奶牛乳腺组织中PRL是否可以调控RANKL表达以及PRL调控RANKL表达分子机制尚未报道。本研究对青春期、泌乳期和干奶期荷斯坦奶牛乳腺组织中RANKL蛋白表达量进行检测,Western blotting结果表明不同时期奶牛乳腺组织中RANKL表达量存在显著差异（P＜0.05）;采用免疫荧光技术对泌乳期奶牛乳腺组织中RANKL表达进行定位检测,激光共聚焦结果表明RANKL主要定位于腺泡腔上皮细胞膜上。这些结果表明RANKL表达受到严格调控,RANKL在不同时期乳腺组织中表达水平存在显著差异;泌乳期时,RANKL主要由腺泡腔上皮细胞产生。为了研究PRL调控RANKL表达的分子机制,本研究以荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞为实验材料,采用不同浓度PRL（0、0.2、1、2.5、5、10μg/m L）处理奶牛乳腺上皮细胞,Western blotting结果表明PRL能诱导奶牛乳腺上皮细胞中RANKL表达（P＜0.05）,在1μg/m L PRL时,RANKL表达量最为显著。为进一步确认PRL调控RANKL表达机制的相关通路,本研究使用催乳素受体干扰RNA（Prolactin Receptor Small Interfering RNA,PRLR Si RNA）和信号转导及转录激活因子5a干扰RNA（Signal Transducersand Activators of Transcription 5a Small Interfering RNA,STAT5a Si RNA）分别处理乳腺上皮细胞处理,Western blotting结果表明PRLR Si RNA和STAT5a Si RNA处理均能显著抑制PRL诱导RANKL的表达（P＜0.05）。这些结果表明PRL能通过PRLR/STAT5a信号通路来参与调控RANKL表达。为探究STAT5a是否能通过调控RANKL基因的启动子活性来影响RANKL基因的表达,本研究构建了含有RANKL基因启动子不同区段的荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶报告基因结果表明PRL能显著增强RANKL启动子活性（P＜0.05）,且PRL相应元件位于RANKL启动子-883～-239bp区域。本研究使用JASPAR数据库对RANKL启动子883～-239bp区域潜在的GAS位点进行预测,结果表明RANKL基因启动子-814～-826 bp（5`-GGTTCCTATAAGC-3`）可能是转录因子STAT5a的结合位点。接着,将预测的潜在GAS位点进行定点突变构建突变型RANKL启动子荧光素酶载体。双荧光素酶检测结果表明,与野生型RANKL启动子载体相比,突变型RANKL基因启动子活性对PRL刺激并不敏感（P＞0.05）,检测结果表明RANKL基因-814～-826 bp（5`-GGTTCCTATAAGC-3`）区域是启动子的核心调控区域。最后,RNAi实验结果表明STAT5a Si RNA能显著抑制PRL诱导的RANKL的启动子活性（P＜0.05）。这些实验结果表明PRL通过转录因子STAT5a来调控RANKL基因的启动子活性,促进RANKL基因表达。为探究RANKL过表达对PRLR/STAT5a以及RANKL/RANK/OPG途径的影响,本研究将构建的RANKL过表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,实验结果表明RANKL过表达能显著促进RANKL蛋白及其同源性受体RANK蛋白在乳腺上皮细胞中的表达（P＜0.05）,与此同时STAT5a的磷酸化水平显著降低（P＜0.05）,STAT5a的表达没有显著变化（P＞0.05）。这些结果表明RANKL过表达对STAT5a的活性存在负反馈调控作用。综上所述,PRL通过PRLR/STAT5a途径调控奶牛乳腺上皮细胞中RANKL表达;RANKL过表达能抑制STAT5a活性,对PRLR/STAT5a途径存在负反馈调控作用。