当机体受到应激原刺激时，维持机体内环境稳定的一个重要生理反应即下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA）轴的激活，促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)分泌增加、进而促进促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)的分泌，最终由肾上腺皮质分泌大量的糖皮质激素（glucocorticoids，GCs）。鉴于GCs的允许作用、调节物质代谢、抗炎、抗过敏、抗休克、免疫抑制以及维持内环境稳定的作用，因此，肾上腺合成糖皮质激素功能的正常维持是机体能够应对各种应激的必要前提。临床研究表明，脓毒症等重症严重性疾病常伴有相对肾上腺功能不全，其主要表现为基础皮质醇的水平低下或者对于ACTH的反应性低下。进一步对其患者的预后进行统计分析后发现，肾上腺皮质反应性低下与患者高死亡率显著相关。关于脓毒症患者发生相对肾上腺功能不全的机制至今仍未完全阐明。硫化氢（hydrogen sulfide, H2S）作为一种新型气体信号分子在体内主要由胱硫醚--合成酶（cystathionine--synthetase, CBS）和胱硫醚--裂解酶（cystathionine--lyase,CSE）催化生成。已有研究表明它可以通过抑制线粒体氧化应激、发挥细胞保护作用。此外，本实验室前期研究结果发现H2S可以在巨噬细胞中抑制内毒素（lipopolysaccharide, LPS）诱导的一氧化氮（nitric oxide, NO）的生成以及诱导性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）表达，从而发挥抗炎作用。然而，内源性H2S合成酶在肾上腺是否有表达？是否参与脓毒症肾上腺皮质反应性的调节尚未可知。因此，本论文研究首先将明确肾上腺中是否存在硫化氢合成酶，同时阐明内源性硫化氢在肾上腺皮质反应性维持中的关键作用；在此基础上，我们将在整体和细胞水平进一步观察内毒素对肾上腺皮质内源性硫化氢合成的影响，并从H2S改善线粒体功能障碍和抑制NO生成的角度探讨内源性H2S逆转内毒素诱导的肾上腺皮质反应性低下的分子机制。主要实验结果如下：一、H2S合成酶在小鼠肾上腺中的表达及活性Western blot和免疫组化的结果显示小鼠肾上腺皮质细胞中有内源性H2S的三种合成酶CBS、CSE和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST)的表达，H2S实时定量检测结果显示小鼠肾上腺细胞能够产生内源性H2S。二、 H2S在小鼠肾上腺中线粒体功能维持中起着关键作用在体实验中，结果显示腹腔注射H2S合成酶CBS阻断剂aminooxyacetic acid(AOAA)和CSE阻断剂DL-propargylglycine (PAG)24h后，小鼠肾上腺线粒体中ROS的生成增多、线粒体膜电位降低、线粒体中ATP的生成减少。另外，我们采用微注射的方法，将胆固醇修饰的Control siRNA、CBS siRNA和CSE siRNA转染到小鼠肾上腺局部，处理24h后，在小鼠肾上腺局部微注射CBS和CSE的小干扰片段RNA（siRNA）CBS siRNA、CSE siRNA48h后，能够显著抑制小鼠肾上腺中H2S的生成速率，并能促进小鼠肾上腺线粒体中ROS的生成，降低线粒体膜电位，抑制线粒体中ATP的生成。离体实验中，结果显示原代培养的小鼠肾上腺细胞转染CBS siRNA、CSE siRNA48h后，肾上腺细胞线粒体中ROS的生成增多，线粒体膜电位及ATP的生成量均降低。此外，H2S的缓释供体GYY4137能够剂量依赖性地逆转CBS siRNA、CSE siRNA诱导的小鼠肾上腺细胞线粒体中ROS生成增多，线粒体膜电位降低及线粒体ATP生成量减少。上述结果提示H2S在小鼠肾上腺线粒体功能的维持中起着关键的作用。三、 H2S在小鼠肾上腺皮质反应性维持中起着关键作用在体实验中，结果显示，腹腔注射H2S合成酶的阻断剂AOAA、PAG及肾上腺局部微注射CBS siRNA、CSE siRNA后，后续给予ACTH二次刺激时小鼠肾上腺皮质合成的皮质酮显著减少。离体实验中，AOAA、PAG、CBS siRNA、CSE siRNA处理原代培养的小鼠肾上腺细胞后，皮质酮检测结果显示后续ACTH诱导原代小鼠肾上腺细胞皮质酮的生成量显著降低。另外，H2S的缓释供体GYY4137能够剂量依赖性地逆转CBS siRNA、CSE siRNA对ACTH诱导小鼠肾上腺细胞皮质酮生成的抑制作用。上述结果提示，H2S对于维持肾上腺皮质细胞分泌糖皮质激素起着重要的作用。四、 LPS诱导小鼠肾上腺中线粒体损伤进而导致相对肾上腺功能不全在体实验中，结果显示腹腔注射LPS（5mg/kg）24h后，小鼠肾上腺线粒体中ROS生成增多，线粒体膜电位和ATP生成量显著降低，线粒体羰基化水平也显著升高。离体实验中，结果显示，LPS（10ng/ml）能够促进原代培养的小鼠肾上腺细胞线粒体ROS的生成，降低线粒体膜电位，抑制线粒体中ATP的生成。此外，超氧化物歧化酶模拟物MnTBAP（100μ M）和线粒体超氧化物清除剂mito-TEMPO（100μ M）均能够逆转LPS诱导的小鼠肾上腺细胞线粒体中ROS生成增多、线粒体膜电位和ATP生成量降低。与此同时，MnTBAP（100μ M）和mito-TEMPO（100μ M）能逆转LPS对ACTH诱导的小鼠肾上腺细胞皮质酮生成的抑制作用。提示，LPS引起小鼠肾上腺细胞中线粒体氧化应激，进而引起线粒体损伤，最终引起相对肾上腺功能不全。这可能是脓毒症时内毒素诱导的相对肾上腺功能不全的机制之一。五、 NO生成增多在LPS诱导小鼠肾上腺中线粒体损伤和肾上腺反应性低下中的作用1.在体实验中，LPS（5mg/kg）可以时间依赖性地促进小鼠肾上腺中iNOS的表达，同时也能够显著地增加小鼠肾上腺组织NO生成量。离体实验中，结果显示LPS（10ng/ml）未能促进原代培养的小鼠肾上腺细胞中iNOS的表达及NO的生成。2.免疫荧光组织化学结果显示，LPS处理组的小鼠肾上腺组织中有较高密度的iNOS染色阳性细胞存在，并且大多数iNOS染色阳性细胞同时也呈现内皮细胞标志物CD31染色阳性，却未呈现巨噬细胞标志物CD68染色阳性。提示，LPS诱导小鼠肾上腺中iNOS表达增多及NO生成量增多主要发生在血管内皮细胞中。3.在体实验中，腹腔注射NO供体硝普钠（Sodium Nitroprusside, SNP,1mg/kg）24h后，小鼠肾上腺线粒体中ROS的生成量显著升高，线粒体膜电位和ATP的生成量也显著降低。离体实验中，SNP（1mM）同样可以促进原代培养的小鼠肾上腺细胞线粒体中ROS的生成，降低线粒体膜电位并抑制线粒体中ATP的生成。提示，NO可以引起肾上腺中线粒体氧化应激和线粒体损伤。4.在体实验中，腹腔注射SNP (1mg/kg)24h后，小鼠肾上腺皮质对ACTH的反应性显著降低。离体实验中，SNP（1mM）同样可以显著抑制ACTH诱导的小鼠肾上腺细胞皮质酮的生成量。提示，NO可以抑制肾上腺皮质的反应性。5.在体实验中，iNOS特异性阻断剂1400W可以部分逆转LPS诱导的小鼠肾上腺中线粒体ROS生成量增多、线粒体膜电位和线粒体中ATP生成量降低。此外，1400W能够逆转LPS诱导的小鼠肾上腺皮质对ACTH反应性低下的现象。提示，LPS可能是通过促进小鼠肾上腺中NO的生成，进而抑制小鼠肾上腺中线粒体损伤及肾上腺反应性。六、LPS对小鼠肾上腺中H2S合成酶的表达的影响在体实验中，腹腔注射LPS（5mg/kg）6h、12h、24h后，Western blot结果显示，LPS能够时间依赖性地抑制小鼠肾上腺组织中CBS和CSE蛋白的表达，而对3-MST蛋白的表达无影响。此外，腹腔注射LPS（5mg/kg）24h后，小鼠肾上腺组织匀浆液中H2S的生成率受到显著地抑制。离体实验中，Western blot结果显示，LPS能够剂量依赖性地抑制原代培养的小鼠肾上腺细胞中CBS和CSE蛋白的表达，对3-MST蛋白的表达无影响。并且LPS（100ng/ml）处理原代培养的小鼠肾上腺细胞24后，小鼠肾上腺细胞中H2S的生成速率同样受到显著地抑制。LPS（1ng/ml-100ng/ml）处理原代培养的小鼠肾上腺细胞24h后，MTT结果显示LPS对于肾上腺细胞的活力并无显著影响。进一步实验，Western blot结果显示蛋白酶体抑制剂MG132（25μ M）可以完全逆转LPS（100ng/ml）对原代培养的小鼠肾上腺细胞中CBS和CSE两种酶的抑制作用。提示，LPS可能通过促进蛋白酶体依赖的蛋白降解过程抑制CBS和CSE表达。七、H2S供体GYY4137减轻LPS和NO诱导的小鼠肾上腺皮质线粒体损伤1.在体实验中，GYY4137（50mg/kg）能够逆转LPS（5mg/kg）诱导的小鼠肾上腺线粒体中ROS生成增多，线粒体膜电位降低，线粒体ATP生成量降低，及线粒体蛋白羰基化水平升高的现象。电镜结果显示，GYY4137能够逆转LPS对于小鼠肾上腺中线粒体结构的损伤。离体实验中，GYY4137（100μ M-500μ M）可以剂量依赖性地逆转LPS（10ng/ml）诱导的原代培养的小鼠肾上腺细胞线粒体中ROS生成增多，线粒体膜电位降低，线粒体中ATP生成量降低，及线粒体蛋白羰基化水平升高的现象。提示，LPS抑制小鼠肾上腺中H2S的生成，进而诱导小鼠肾上腺中线粒体氧化应激和线粒体损伤。2.在体实验中，Western blot结果及免疫荧光结果显示GYY4137（50mg/kg）能够逆转LPS（5mg/kg）诱导小鼠肾上腺中iNOS表达及NO的生成。3.在体实验中，GYY4137（50mg/kg）能够减弱SNP（1mg/kg）诱导的小鼠肾上腺中线粒体氧化应激（线粒体中ROS生成量增多）和线粒体损伤（线粒体膜电位降低，ATP生成量减少）。离体实验中，我们同样发现GYY4137（500μ M）能够逆转SNP（1mM）诱导的原代培养的小鼠肾上腺细胞线粒体中ROS生成量增多，线粒体膜电位降低，ATP生成量减少的现象。提示，H2S可能通过抑制肾上腺中NO的生成，进而维持肾上腺中线粒体的正常功能。八、H2S供体GYY4137逆转LPS和NO诱导的小鼠肾上腺反应性低下1.在体实验中，GYY4137（50mg/kg）能够逆转LPS（5mg/kg）诱导的小鼠肾上腺反应性低下的现象。离体实验中，GYY4137（100μ M-500μ M）可以剂量依赖性地逆转LPS（10ng/ml）对ACTH诱导原代培养的小鼠肾上腺细胞皮质酮生成的抑制作用。2.在体实验中，GYY4137（50mg/kg）能够逆转SNP（1mg/kg）诱导的小鼠肾上腺反应性低下的现象。离体实验中，GYY4137（500μ M）可以逆转SNP（1mM）对ACTH诱导原代培养的小鼠肾上腺细胞皮质酮生成的抑制作用。九、肾上腺中内源性硫化氢对内毒素血症小鼠死亡率的影响采用微注射的方法将胆固醇修饰的Control siRNA、CBS siRNA和CSE siRNA转染到小鼠肾上腺局部，处理24h后，再腹腔注射LPS（5mg/kg），结果发现CBS siRNA和CSE siRNA本身对于小鼠的生存率无显著影响；然而，敲低小鼠肾上腺局部CBS和CSE蛋白的表达能够显著增加内毒素血症小鼠的死亡率。CBS siRNA和CSEsiRNA增加内毒素血症小鼠死亡率的现象能够被GYY4137治疗显著逆转。提示，这些结果表明局部敲低小鼠肾上腺中H2S合成酶的表达能够增加内毒素血症小鼠的死亡率。结论：1．小鼠肾上腺皮质中存在硫化氢合成酶，能够内源性生成H2S；内源性H2S在肾上腺皮质细胞线粒体功能和肾上腺皮质反应性维持中均起重要作用；2．内毒素导致肾上腺皮质细胞中硫化氢合成酶CBS和CSE表达显著降低、H2S生成减少，这是内毒素诱导肾上腺皮质细胞线粒体功能障碍、肾上腺皮质反应性低下的重要机制之一；3．给予H2S供体GYY4137可以显著抑制内毒素诱导的线粒体功能障碍和NO生成增多，从而逆转内毒素诱导的肾上腺皮质反应性低下。这一结果提示外源性补充H2S可能可以成为临床治疗脓毒症诱导的肾上腺皮质功能不全的有效手段。