近年来,重金属(如铅、汞、砷和铬等)的污染越来越严重,常常发生重金属离子中毒,影响着人类的健康和生命。铅离子和汞离子进入人体,并且在人体的某些器官中沉积,造成人体不同程度的中毒等危害。因而建立简单、快速,灵敏检测铅离子和汞离子的分析方法具有十分重要的意义。脱氧核酶(简称DNAzyme)是具有与蛋白酶以及RNA类似催化活性的一类DNA分子。DNAzyme是通过体外筛选、扩增技术得到的。大多数DNAzyme依赖于金属离子激发其活性而发生催化反应。与蛋白酶和RNA相比,DNAzyme具有廉价、稳定性好、多次复性而不失去结合能力等优点。因此,DNAzyme被广泛应用于金属离子(例如Pb2+、Zn2+、Co2+等)的检测。金属离子与寡核苷酸之间由于共价作用形成“metal-basepairs”的结构,例如双链DNA中的胸腺嘧啶(T)与Hg2+以1:2形成T-Hg-T的结构,这些结构可应用Hg2+的检测。目前,基于DNAzyme和寡核苷酸与金属离子特异性反应,研制高灵敏度和高选择性生物传感器是生物传感器研究的热点之一。电化学发光生物传感器是将生物分子识别物质固定在电极上,并将生物分子识别物质和目标分析物结合的生物信号转化为电化学发光信号的一种分析器件。它兼有电化学和化学发光传感器的优点,已经被广泛用于DNA、抗原/抗体,酶等的检测。本论文旨在研制高灵敏度、高选择性、可再生检测Pb2+,Hg2+等电化学发光生物传感器。本论文设计了基于DNAzyme和Pb2+,胸腺嘧啶(T)和Hg2+以及甘露糖和伴刀球蛋白之间的特异性识别的电化学发光生物传感器。建立了通过树枝状高分子多负载电化学发光探针的信号放大策略;建立了共价固定化和“点击化学”固定化电化学发光探针的新方法。本论文研制了增强型和非标记型Pb2+电化学发光生物传感器;研制了多标记和多负载型的Hg2+电化学发光生物传感器;研制了一种基于目标替换的凝集素电化学发光糖生物传感器。本论文由六章组成。第一章为引言。引言部分介绍了生物传感器的构造与优点、生物传感器的分类以及金属离子生物传感分子识别物质;重点总结了金属离子生物传感的研究进展;提出了构建电化学发光生物传感器的一些新策略;简要提出了本论文的目的和意义以及主要研究内容。第二章为增强型Pb2+电化学发光生物传感器的研究。本章旨在研制一种高灵敏度和可再生的信号增强型Pb2+电化学发光生物传感器。传感器的设计以8-17DNAzyme为分子识别物质和Ru(bpy)32+衍生物(Rul)为电化学发光信号物质,将5’末端修饰氨基,3’末端标记Rul的17E(简称Rul-17E’)作为电化学发光探针。首先将Ru1-17E’共价固定于对氨基苯甲酸修饰石墨电极表面,然后将含有核苷酸腺苷(rA)的互补底物链与电极表面的Rul-17E’杂交形成刚性的DNA双链(Rul-17E’·17DS复合物)。当没有Pb2+存在时,Rul远离电极表面,电化学发光信号很弱;当Pb2+存在时,Rul-17E,·17DS·Pb2+在底物链rA处将17DS水解切断成两部分,17DS从DNA双链脱离,DNA双链变为自由卷曲的单链,使Rul接近电极表面,导致电化学发光信号增强。该传感器有较高的灵敏度、稳定性,选择性和再生性。在选定条件下,电化学发光强度变化值与Pb2+浓度在5.0 pmol/L～80 pmol/L之间呈线性关系,检出限为1.4 pmol/L。该传感器对0.2 nmol/L Pb2+作用,在+1.35V电位下重复扫描32圈,相对标准偏差为6.0%。利用电化学发光法计算Rul-17E’·17DS和Pb2+之间的解离常数为22.2μmol/L。本工作表明利用Rul标记DNAzyme作为电化学发光探针和共价固定电化学发光探针可以实现电化学发光生物传感器的高灵敏度、稳定性,选择性和再生性。第三章为非标记型Pb2+电化学发光生物传感器的研究。本章旨在研制一种高灵敏度、良好稳定性的非标记型Pb2+电化学发光生物传感器。传感器的设计以GR-5DNAzyme为分子识别物质,Ru(phen)32+为电化学发光信号物质,利用“点击化学”将含有炔基的酶链(5E’)固定在4-叠氮苯胺修饰的玻碳电极表面,然后将含有核苷酸腺苷(rA)的互补底物链(5DS)与固定于电极表面的5E’杂交形成刚性的DNA双链(5E’·DS)。结合Pb2+前,Ru(phen)32+嵌入5E’·DS双链中,电化学发光信号强;当结合Pb2+后,5E,·DS中底物链rA处被水解断裂,5E’·DS由双链变成自由卷曲的单链,Ru(phen)32+从单链上脱落,脱离电极表面,因而电化学发光强度降低。本文优化了“点击化学”反应的时间(20分钟)、Pb2+反应时间(20分钟),工作电位(1.3V)、Ru(phen)32+浓度(140 μmol/L)等,在优化的实验条件下,检测Pb2+的线性范围为20pmol/L～1.0nmol/L,相关系数为0.9922,检出限为7.2pmol/L。研究结果表明该传感器具有高灵敏度、易再生和稳定好等优点。本研究结果为构建其他金属离子的非标记型电化学发光生物传感器提供一个研究平台。第四章为多标记型汞离子电化学发光生物传感器的研究。本章旨在探讨树枝状高分子作为电化学发光物质载体对于提高电化学发光分析法灵敏度的潜在优势和研制一种高灵敏度、高选择性,良好的稳定性和可再生的Hg2+电化学发光生物传感器。以第四代聚酰胺-胺高分子(G4-PAMAM)为模型,将羧基钌联吡啶配合物(Rul)共价键合在G4-PAMAM外围制备成Rul功能化的G4-PAMAM(dend-Rul)。利用核磁谱、红外吸收谱,紫外可见吸收光谱和元素分析对制备的dend-Rul进行表征;利用电化学发光法证明了dend-Rul可作为载体提高电化学发光分析方法的灵敏度。传感器的设计以富含T碱基的寡核苷酸(MSO)为分子识别物质,dend-Rul为标记物,将5’末端修饰氨基,以6个-CH2-和聚乙二醇(EG6)为连接臂,3’末端标记dend-Rul的MSO(简称(CH2)6-(EG)6-MSO-dend-Rul)为电化学发光探针。将电化学发光探针通过共价键固定于碳纳米管修饰玻碳电极表面,未结合Hg2+时,dend-Rul远离电极表面,产生的电化学发光信号弱;结合Hg2+后,由于T-Hg-T结构的形成使MSO的结构由直链变为发卡式,从而使dend-Rul接近电极表面导致电化学发光信号增强。通过5种类型电化学发光生物传感器的比较,以dend-Rul为标记物和SWNTs/GCE为传感器界面制备的传感器信号响应最佳;通过对连接臂长度的优选,确定电化学发光探针为(CH2)6-(EG)6-MSO-dend-Rul时,制备的传感器性能最佳;通过电化学发光探针在构建传感器过程中的浓度优选有效降低了传感器的背景信号和促进了电化学探针与Hg2+的相互作用。在优化条件下,电化学发光强度的变化值与Hg2+浓度的对数在7.0pmol/L～0.1μmol/L之间呈线性关系,检出限为2.4pmol/L。通过郎缪儿等温吸附线拟合,计算出电化学发光探针与Hg2+的结合常数(Kb=8.05±0.3×108mol-1·L)。另外,该传感器具有好的稳定性,再生性和贮存稳定。本研究工作表明树枝状高分子作为电化学发光信号物质的载体可以提高电化学发光传感器的灵敏度,利用聚乙二醇作为连接臂可以降低传感器的背景和促进探针与目标物的结合。第五章为多负载型汞离子电化学发光生物传感器的研究。本章旨在研制一种高灵敏度,良好选择性和可再生的Hg2+电化学发光生物传感器。传感器的设计利用第四代聚酰胺-胺高分子(G4-PAMAM)和单臂碳纳米管(SWNTs)修饰玻碳电极,以MSO为分子识别物质,Ru(bpy)32+衍生物(Rul)为电化学发光信号物质,将Rul标记的MSO作为电化学发光探针通过共价键固定于修饰G4-PAMAM和SWNTs的玻碳电极表面,未结合Hg2+时,Rul远离电极表面,产生的电化学发光信号弱;结合Hg2+后,由于T-Hg-T结构的形成使MSO的结构由直链变为发卡式,从而使Rul接近电极表面导致电化学发光信号增强。在优化的实验条件下,检测Hg2+的线性范围为0.1nmol/L～50.0nmol/L,检出限为0.04nmol/L。通过郎缪儿等温吸附线拟合,计算出电化学发光探针与Hg2+的结合常数(Kb= 3.82±0.3×108mol-1·L)。研究结果表明该传感器具有高灵敏度,高选择性和稳定好等优点。本研究结果为提高电化学发光生物传感器灵敏度提供了一个研究思路。第六章为目标替换伴刀球蛋白电化学发光糖传感器的研究。本章旨在设计简单,灵敏检测凝集素的电化学发光糖生物传感器。传感器的设计以甘露糖为分子识别物质,伴刀球蛋白(Con A)为目标检测物,Ru(bpy)32+衍生物(Ru)为电化学发光信号物质。以戊二醛为交联剂和聚乙二醇为连接臂将甘露糖固定于修饰对苯二胺的金电极表面,Ru(bpy)32+衍生物标记的Con A(Ru-ConA)与电极表面固定的甘露糖特异性结合。当目标Con A存在时,由于未标记Con A与甘露糖的结合力大于Ru-Con A与甘露糖的结合力,因而电极表面部分Ru-Con A被替换从而离开电极表面,导致电化学发光强度降低。在选定条件下,电化学发光积分值与Con A浓度的对数在0.6nmol/L～0.7μmol/L之间呈线性关系,检出限为0.27 nmol/L。对0.17 nmol/L的Con A连续进行11次测定,相对标准偏差为2.5%。该研究结果表明利用目标待测物Con A替换传感器中的Ru-Con A和共价固定甘露糖的策略对构建电化学发光糖生物传感器提供了一个研究平台,并且为研究糖与凝集素之间的相互作用提供了一种新的思路。该传感器有望推广至用于其他凝集素的检测。本论文研制了信号增强型、非标记型,多标记/多负载信号放大型金属离子电化学发光生物传感器和目标替换伴刀球蛋白电化学发光糖传感器,为分析检测超痕量铅离子和汞离子提供了性能优良的分析器件和分析新方法,为电化学发光生物传感器的研究提供了一些新思路和基础性研究资料。研究表明,对氨基苯甲酸通过电化学氧化以C-N键修饰于石墨电极表面,电化学发光探针通过共价键固定于对氨基苯甲酸修饰的石墨电极表面,该固定化方法克服了钌联吡啶衍生物标记的电化学发光探针以Au-S键固定金电极表面,在工作电位高于0.8V由于Au-S键的断裂从而影响了电化学发光生物传感器的稳定性乃至再生性能的弊端;树枝状高分子表面具有大量的功能基团可以多标记信号物质和多负载电化学发光探针,能够大大提高电化学发光生物传感器的灵敏度;“点击化学”反应固定化方法克服了传统共价键固定化方法的副产物高和易水解等缺点,能够提高电化学发光生物传感器的稳定性,构建了高灵敏度、高选择性、良好稳定性和可再生的铅离子和汞离子电化学发光生物传感器。本论文为拓展电化学发光生物传感器在金属离子检测领域的应用提供了研究平台。本论文为研究糖与凝集素之间的相互作用提供了一个新的研究方法。本论文的研究策略可以扩展至电化学发光、电化学生物传感器和芯片实验室等以DNA/RNA、DNAzyme、适配体以及抗原/抗体等为生物识别物质用于定量检测目标物和研究生物识别物质与日标物之间相互作用的分析器件中。