五没食子酰基葡萄糖抑制卵巢癌细胞增殖及其机制的研究

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五没食子酰基葡萄糖(pentagalloylglucose ,PGG)是一种天然多酚化合物,自然界中分布及其广泛。之前的研究表明PGG具有多种生物活性,具有治疗和预防一些重要疾病如炎症、肿瘤以及糖尿病的潜能,对宿主没有毒副作用。卵巢癌是主要的妇科肿瘤之一,目前没有有效的治疗药物。本课题选取不同的卵巢癌细胞株作为实验对象,研究五没食子酰基葡萄糖对卵巢癌细胞增殖的影响,并初步探讨可能的分子机制。实验方法:1.使用MTT实验研究PGG在体外对卵巢癌HO-8910、HO-8910PM与SKOV-3细胞增殖的影响,使用普通光学倒置显微镜观察PGG处理后细胞形态改变。2.使用PI单染流式细胞检测分析PGG对卵巢癌细胞细胞周期分布影响;使用Hoechst染色PGG处理之后的细胞,在荧光显微镜下观察细胞核形态的变化,看是否出现凋亡特征,然后使用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞分析检测PGG对卵巢癌细胞凋亡率的影响。3. Western blot用于检测细胞内Caspase家族成员的剪切情况,出现Caspase相应的剪切小片段证明PGG激活了细胞内Caspase凋亡信号通路;Western blot还用于检测NF-κB转录因子的P65亚基与其抑制蛋白IκB在细胞质与细胞核中的分布变化,确定PGG对NF-κB信号通路的影响。4. RT-PCR用来研究PGG对NF-κB的靶基因bcl-2、bcl-xl、ciap-1、ciap-2、survivin、niap、xiap、cyclinD1转录影响,这些基因是肿瘤细胞中的促存活基因。实验结果1. PGG能以时间与浓度依赖的方式抑制卵巢癌细胞HO-8910、HO-8910PM与SKOV-3体外增殖,当PGG剂量大于20μM,或作用时间达到48 h时,PGG对卵巢癌细胞的抑制呈现出明显的时间与剂量依赖关系(P<0.05)。2. PGG改变三株卵巢癌细胞的细胞周期分布,诱导卵巢癌HO-8910与HO-8910PM细胞凋亡。随着PGG处理剂量增加与作用时间延长,细胞周期向S-期富集。Hoechst染色显示,PGG诱导了HO-8910细胞的核发生凋亡样形态改变,对SKOV-3细胞膜与细胞核形态没有影响;AnnexinV-FITC染色结合流式细胞分析显示PGG诱导HO-8910与HO-8910PM细胞凋亡出现早期凋亡,但是对SKOV-3细胞凋亡影响较小。3. PGG处理之后卵巢癌细胞内出现了几个Caspases家族成员的活性形式,出现相应的c-Caspase-9、3、7;PGG虽然上调了外源性凋亡途径中上游的肿瘤坏死因子受体表达,但是抑制了Caspase-8的剪切。4. PGG处理卵巢癌细胞抑制转录因子NF-κB的P65亚基核转位,伴随着其抑制性蛋白IκB在细胞质中积累;相应地,PGG下调了NF-κB的几个靶基因bcl-2、bcl-xl、surviving、niap、xiap、cyclinD1的mRNA表达。但是上调了ciap-1、ciap-2的mRNA的表达,对bax的mRNA表达没有影响。结论PGG能抑制卵巢癌细胞的体外增殖,其机制涉及PGG诱导细胞周期S-期阻滞与诱导细胞凋亡。PGG可能通过抑制细胞内致癌转录因子NF-κB的活性,下调其凋亡抑制基因的表达,诱导细胞进入内源性Caspase凋亡途径,从而导致细胞死亡。
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