研究背景：2型糖尿病是危害人类健康的常见慢性非传染性疾病,在中医学归属于“消渴”范畴,有“肺消”、“鬲消”等名称。最新资料显示,我国糖尿病患者超过1亿,18岁以上糖尿病患病率高达11.6%,其中95%以上都是2型糖尿病。2型糖尿病发病机制复杂,主要由于胰岛素抵抗和／或胰岛素分泌不足引起。葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的膜转位障碍,是导致胰岛素抵抗的重要因素之一。GLUT4只有在细胞膜上才能发挥转运葡萄糖进入细胞的作用,这是葡萄糖代谢的限速步骤。骨骼肌、脂肪细胞膜上GLUT4的数量和活性,决定了机体对葡萄糖的摄取和利用,也决定了机体胰岛素的敏感性。脂肪细胞摄取的葡萄糖总量虽然不及骨骼肌细胞,但是脂肪组织的对机体的胰岛素敏感性特别重要。因为脂肪组织能缓冲过多的能量,脂肪细胞可以释放许多脂肪因子调节能量代谢平衡,脂肪酸能干扰葡萄糖信号传导,脂肪酸氧化代谢受损可导致GLUT4的膜转位障碍和胰岛素抵抗。祖国医学从肝火、痰浊、瘀血、内毒、脾虚等不同角度采用疏肝清热、泻火解毒、活血化瘀、健脾化痰等方法,来改善胰岛素抵抗取得了较好的疗效。中药重在整体调节,中药复方则通过多环节、多途径来改善机体胰岛素抵抗状态,与降低血糖、调整血脂、纠正代谢紊乱等综合干预的治疗原则相符。研究表明,小檗碱具有改善胰岛素抵抗、降低血糖、纠正脂质紊乱和胰岛素增敏作用,且无明显增加体重和水潴留等不良反应,而甘丙肽能增加动物的摄食而导致肥胖。我们过去的研究发现,腹腔注射甘丙肽受体拮抗剂M35能够显著降低健康及2型糖尿病大鼠胰岛素的敏感性,减少脂肪和肌肉组织对葡萄糖的摄取与利用,提示内源性甘丙肽通过作用外周胰岛素敏感组织上的受体,增加胰岛素的敏感性,降低胰岛素抵抗。然而,目前尚不清楚中枢甘丙肽能否调节胰岛素敏感性,以及小檗碱能否协同甘丙肽而达到增强胰岛素敏感性的效应。本研究运用2型糖尿病鼠模型,探讨中枢甘丙肽对脂肪组织胰岛素敏感性影响,以及小檗碱分别与甘丙肽、2型甘丙肽亚型受体(GALR2)特异性激动剂和拮抗剂联用导致的缓解胰岛素抵抗的效应,从而了解小檗碱能否协同甘丙肽降低脂肪组织胰岛素抵抗及其信号通路,加深对小檗碱改善2型糖尿病鼠胰岛素抵抗机制的认识,为联用小檗碱与无增重效应的GALR2激动剂,以达到更好的降低胰岛素抵抗疗效提供实验依据,有重要的理论和临床意义。研究目的：了解中枢甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪细胞胰岛素抵抗的作用,判断小檗碱能否协同甘丙肽以及GALR2激动剂降低2型糖尿病鼠脂肪组织胰岛素抵抗及其信号通路。研究方法：1、为了解中枢甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪细胞胰岛素抵抗的作用,本研究将跑台训练作为促进大鼠内源性甘丙肽分泌的生理刺激,侧脑室注射甘丙肽特异拮抗剂M35以阻断中枢甘丙肽的作用。观察在阻断内源性甘丙肽的条件下,糖尿病安静M35组和糖尿病运动M35组大鼠相对于糖尿病安静对照和糖尿病运动对照,在正葡萄糖钳夹实验中葡萄糖的滴注速率和脱氧葡萄糖2DG含量变化；ELISA法检测血浆中胰岛素、甘油三酯、胆固醇浓度的改变；应用Western blot法测定脂肪细胞内外膜GLUT4蛋白含量和Real-timePCR技术检测下丘脑中GAL mRNA表达的改变,依此推断内源性GAL在调节2型糖尿病大鼠脂肪组织胰岛素抵抗过程中的作用。2、为了判断小檗碱能否协同甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪组织胰岛素抵抗及其信号通路,实验大鼠分别单独及联合给予小檗碱、甘丙肽和Akt抑制剂MK-2206。通过比较糖尿病小檗碱+甘丙肽组大鼠相对于糖尿病小檗碱对照和糖尿病甘丙肽对照脂肪细胞脱氧葡萄糖2DG的变化,用Real-time PCR技术测定脂肪细胞中GLUT4 mRNA表达水平以及应用Western blot法测定脂肪细胞膜3LUT4和囊泡相关性膜蛋白2(VAMP2)蛋白浓度的改变,从而推断联合运用小檗碱和甘丙肽比单独运用这两种药物中的任何一种是否能进一步提高胰岛素敏感性；此外,应用Western blot法测定脂肪细胞膜Akt、pAkt、pAkt2Thr308、 pAkt2Ser473、pAS160Thr462、叉头状转录因子O1(pFoxO1)、糖原合成酶激酶-3β(pGSK-3β)含量,用Real-time PCR技术测定脂肪细胞中Akt2 mRNA的表达水平,从而了解联合运用小檗碱和甘丙肽比单独运用这两种药物中的任何一种,对Akt以及其下游信号蛋白磷酸化的影响,从而推断Akt信号通路是否参与了小檗碱协同甘丙肽降低2型糖尿病大鼠脂肪组织胰岛素抵抗的过程。3、为了判断小檗碱能否协同GALR2激动剂降低2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗,实验糖尿病小鼠分别给予小檗碱、GALR2激动剂M1896及GALR2拮抗剂M871,对照小鼠给予生理盐水。记录小鼠进食量和实验前后称体重；用快速血糖仪测定空腹血糖；糖耐量试验了解小鼠胰岛素敏感性；ELISA法测定血浆胰岛素、C反应蛋白、脂联素、甘丙肽、瘦素浓度；Western blot法了解脂肪细胞GLUT4含量与膜转位的蛋白水平：Real-TimePCR法检测脂肪组织中GLUT4 mRNA的含量。比较糖尿病小檗碱+激动剂组小鼠相对于糖尿病小檗碱对照和糖尿病激动剂对照实验前后称体重和血糖的改变,胰岛素敏感性指标的变化,据此判断小檗碱能否协同GALR2激动剂降低2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗,同时不影响动物的进食量和体重。研究结果：1、运动能够显著诱导健康及2型糖尿病大鼠中枢GALmRNA表达；中枢注射M35后,大鼠体重显著下降,血糖显著升高,葡萄糖输注速率和2-DG水平显著下降,胰岛素分泌显著升高,胆固醇和甘油三酯水平显著升高。脂肪细胞GLUT4蛋白总量显著降低,GLUT4由细胞内膜向细胞外膜的转位量显著减少。2、联合给予小檗碱和甘丙肽大鼠的脂肪细胞2-DG浓度、GLUT4总量、细胞外膜GLUT4和VAMP2浓度显著高于糖尿病甘丙肽组和糖尿病小檗碱组,而脂肪细胞GLUT4 mRNA表达水平以及脂肪细胞内膜GLUT4含量均无显著改变。另外,小檗碱+甘丙肽组大鼠脂肪细胞中pAkt2Thr308和pAkt2Ser473表达水平、pAkt/Akt比率以及Akt2 mRNA表达水平显著高于糖尿病甘丙肽组和糖尿病小檗碱组。在Akt2的下游蛋白中,小檗碱+甘丙肽组大鼠脂肪细胞的pAS160Thr462表达水平高于糖尿病甘丙肽组和糖尿病小檗碱组,而FoxO1和GSK-3p的表达显著低于糖尿病甘丙肽组和糖尿病小檗碱组。Akt抑制剂MK-2206能有效拮抗小檗碱协同GAL引致的上述改变。3、糖尿病小鼠中枢运用GALR2激动剂后,胰岛素和CRP分泌以及血糖水平显著降低,脂联素和瘦素分泌以及葡萄糖清除率增加,胰岛素抵抗降低,脂肪细胞GLUT4mRNA表达及GLUT4蛋白总量显著增加,GLUT4由细胞内膜向细胞外膜的转位显著增加,且无增加摄食量和体重效应。相对于糖尿病甘丙肽组和糖尿病小檗碱组,小檗碱与GALR2激动剂联用后,糖尿病小鼠摄食量和体重显著减少,血糖显著降低,脂联素和瘦素分泌以及葡萄糖清除率显著增加,CRP分泌和胰岛素抵抗显著下降,脂肪细胞GLUT4mRNA表达及GLUT4蛋白总量显著增加,GLUT4由细胞内膜向细胞外膜的转位显著增加。结论：1、中枢注射M35使糖尿病大鼠脂肪细胞GLUT4的转位和摄取葡萄糖的能力下降,胰岛素抵抗增强。提示内源性甘丙肽具有促进GLUT4数量增多和膜转位的功能,甘丙肽是促进葡萄糖跨膜转运的重要激素之一。没有甘丙肽作用,胰岛素促进葡萄糖摄取的功能下降,甘丙肽是维持机体血糖平衡的不可缺少的重要因素。2、小檗碱能通过Akt2信号蛋白途径增强甘丙肽缓解胰岛素抵抗的作用,但是小檗碱不能进一步提高脂肪细胞的甘丙肽总量。用抑制剂MK-2206阻断Akt的作用后,小檗碱不能进一步提高甘丙肽改善胰岛素抵抗的作用。因此,小檗碱增强甘丙肽缓解胰岛素抵抗的作用具有Akt依赖性。3、小檗碱与GalR2激动剂联用相比较于单独使用小檗碱或GALR2激动剂,能显著提高糖尿病小鼠胰岛素敏感性。由于激活GALR2无甘丙肽诱导出现的增加体重的效应,因此,联用小檗碱与GALR2激动剂提供了一个不增加体重而又可有效防治胰岛素抵抗的新途径,为治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病提供了新思路。