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【研究背景】肝癌是一种发生于肝脏上的恶性肿瘤,其中肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前发病率和死亡率最高的原发性肝癌。肝细胞肝癌手术难度大,风险高且安全性差,利用术中实时显像技术可清楚地观察到肿瘤边缘,极大地提升手术质量。近红外荧光(Near-infrared fluorescence,NIRF)染料具有肿瘤聚集能力,可通过荧光显像系统实时观察到肿瘤的范围与边界。最具有代表性的NIRF染料为吲哚青绿(Indocyanine green,ICG),自上世界90年代起就已经应用于胃底血管造影术,四肢淋巴结显像,胃癌与乳腺癌的淋巴结标记等。2009年,Ishizawa等首次报道了ICG分子荧光成像可以用于指导肝癌切除术,此后,人们对于NIR荧光染料在肝脏肿瘤的诊断和术中导航的探索也逐步深入。MHI-148是近年来发现的一类新型七甲川花菁类NIRF染料,多项研究表明其具有良好的肿瘤组织特异性聚集能力。然而,关于该染料在肝癌的靶向成像性能方面的研究还尚不全面,因此,我们在本课题中将对MHI-148在HCC细胞中的成像能力、聚集原理、生物安全性等方面做进一步的研究。关于该染料在肿瘤组织的聚集原因,目前普遍认为是由细胞膜上的有机阴离子转运多肽(Organic anion transporting polypeptide,OATP)所介导的,在本实验研究中我们也发现,HCC细胞SNU-739经OATP抑制剂处理后,MHI-148的聚集量显著减少。然而,关于MHI-148在肿瘤细胞中的外排机制尚不十分清楚,有待系统研究。ABC(ATP-bindingcassette transporter)蛋白家族是一大类跨膜蛋白,能够将与其结合的底物运出细胞外。其中,ABCG2(ATP binding cassettesubfamily G member 2)已经被证明参与众多细胞内、外源物质的排出,同时在肿瘤细胞多药耐药中发挥重要作用;此外,有研究表明细胞经此蛋白的抑制剂处理后,能够显著增加染料如Hoechst 33342在细胞中的聚集量。我们课题组在前期实验中发现,HCC细胞经ABCG2的特异性抑制剂KO143处理后,细胞中的MHI-148聚集量显著增多。在此实验基础上,本课题预进一步探究ABCG2外排蛋白在HCC细胞及HCC组织外排MHI-148中发挥的作用,填补NIR荧光染料外排机制相关研究的空白,并为进一步构建难以被肿瘤组织排出的,肿瘤富集能力更优的近红外荧光染料提供理论基础。【研究目的】1.通过体外实验探究近红外染料MHI-148在HCC细胞的聚集性能、亚细胞定位及生物安全性等,为开展MHI-148指导肝癌术中导航相关临床试验提供理论基础。2.体内外实验探究ABCG2外排蛋白在HCC细胞集聚MHI-148中发挥的作用,填补NIR荧光染料外排机制相关研究的空白,为进一步构建难以被肿瘤组织排出的,肿瘤富集能力更优的近红外荧光染料提供理论基础。【研究方法】1.不同浓度MHI-148染料孵育SNU-739细胞,筛选出最佳孵育浓度;2.体外培养L-02细胞以及人HCC细胞系,细胞经MHI-148染料孵育后于共聚焦激光显微镜下(配备有ICG滤波片,激发/发射:750～800 nm/820～860 nm)拍摄细胞荧光图片,用Image J软件进行荧光值分析,比较MHI-148染料在正常肝细胞和人HCC细胞中的聚集性差异;3.MHI-148分别与线粒体或溶酶体示踪剂共同孵育SNU-739细胞,探究MHI-148在HCC细胞器中的定位情况;4.OATP抑制剂处理SNU-739细胞,探究OATP转运蛋白在HCC细胞集聚MHI-148中的作用;5.CCK-8细胞活性法检测MHI-148的生物安全性;6.利用不同浓度KO143处理HCC细胞SNU-739,探究MHI-148在HCC细胞中聚集量对KO143浓度的依赖性7.构建稳定干涉、过表达ABCG2的HCC细胞株,体外实验验证ABCG2在HCC细胞外排MHI-148中发挥的作用;8.构建人HCC细胞异种移植小鼠模型,体内实验验证ABCG2表达降低是否增强MHI-148在HCC组织中的聚集。【研究结果】1.体外实验发现,MHI-148在HCC细胞中的最佳孵育浓度为15μM,且在HCC细胞中的聚集能力显著优于正常肝细胞L-02;2.共定位实验发现,MHI-148主要聚集于HCC细胞的线粒体和溶酶体中;3.抑制OATP蛋白后MHI-148在HCC细胞中的聚集能力显著降低;4.在293T和L-02细胞的细胞活力实验中发现,MHI-148存在一定的毒性;5.HCC细胞经0.8μM KO143处理后显著增加了MHI-148在HCC细胞中的聚集;6.体内外实验初步验证了抑制ABCG2能够减少MHI-148在HCC细胞和HCC组织中的外排,达到增加MHI-148在HCC细胞和HCC组织中聚集量的作用。【研究结论】本课题研究证实了MHI-148能够特异性聚集于HCC细胞,通过OATP蛋白介导进入HCC细胞并滞留于线粒体和溶酶体中,具有一定的毒副作用;初步证明了抑制ABCG2能够增加MHI-148在HCC细胞及HCC组织中的聚集。