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目的：体外分离、培养小鼠精原干细胞（mSSCs）；诱导其定向分化，检测生殖细胞核因子（GCNF）和Oct-4在mSSCs诱导分化前后的表达。本研究将有助于进一步阐明精子发生的分子机制，为转基因技术和临床生殖医学的诸多方面提供参考。
方法：应用酶消化6-8天新生小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液，以DMEM+10％胎牛血清+白血病抑制因子（LIF）+L-谷氨酰胺等为培养基进行培养。用碱性磷酸酶（AKP）细胞化学染色，c-Kit、oct-4和GCNF间接免疫荧光对原代培养的mSSCs进行鉴定；用干细胞因子（SCF）诱导mSSCs向精母细胞分化，通过间接免疫荧光染色和RT-PCR，检测GCNF和Oct-4在mSSCs诱导分化前后的表达。
结果：细胞接种培养后，睾丸支持细胞（Sertoli）贴壁速度较快且呈成纤维细胞样等不规则形状，而mSSCs贴壁速度较慢且一直呈圆形或椭圆形，核大、胞质较少，48h后，有mSSCs克隆形成。这些mSSCs克隆具有AKP活性，c-kit和Oct-4间接免疫荧光染色均呈阳性。mSSCs向精母细胞方向诱导2天后，Oct-4表达下调，而GCNF转为阳性表达，上述GCNF和Oct-4间接免疫荧光染色的阳性反应主要定位于细胞核。RT-PCR与间接免疫荧光的结果基本一致，即诱导2天后，Oct4表达下调，而GCNF转为阳性表达。
结论：
（1）成功建立了mSSCs的体外培养体系，为mSSCs的体外研究提供了一种便捷的方法。
（2）首次观察到GCNF在体外培养mSSCs向精母细胞分化的早期有表达，且GCNF的表达与Oct-4基因的表达呈负相关。提示GCNF可能参与了SSCs的早期分化，GCNF可能是通过抑制了Oct-4的表达参与SSCs分化。
（3）本研究结果显示，GCNF在体外培养的mSSCs中表达为阴性，当诱导其分化后GCNF开始表达，提示GCNF的表达可作为鉴别mSSCs是否分化的标志。
（4）GCNF在mSSCs定向分化中可能发挥的作用以及mSSCs的分化机制有待于进一步的研究。