研究背景与目的血型鉴定是保证输血安全的关键手段,随着医学的发展,越来越多的血型系统、血型抗原被证实与输血安全密切相关,对更多的抗原靶标进行快速准确的鉴定可进一步提高个性化医疗服务水平。然而,目前临床使用的血清学方法只能进行单个血型抗原靶标检测,更多血型抗原数量的分析将显著增加检测时间并提高人力和经济成本。为此,本研究分别基于固相微阵列技术与液相微阵列技术,利用其高通量优势,同时结合磁珠和荧光编码微球的标记技术,分别探索了磁珠标记的微阵列血型鉴定技术和荧光编码微球标记的血型鉴定技术,以达到快速检测多个血型抗原的目的。研究方法磁珠标记的微阵列血型鉴定技术中,使用的反应基片经过醛基多聚分子修饰,在基片表面形成具有三维结构的醛基聚合物,可以偶联抗体蛋白分子。检测前先用Tris-HCl(pH=7.3~7.5)裂解红细胞标本,并将0.2μl处理后的待测标本加在固定有抗体探针的样点上,随后用0.2μl磁珠标记的C1q识别抗原抗体复合物,最后在磁力吸附下将未结合的磁珠清除。在定量分析中,对每个微陈列检测点摄影后,用Photoshop进行图像分析识别信号强度。经技术改进,在传统的液相微阵列技术的基础上,结合了荧光编码微球标记技术,探索了荧光编码微球标记的微阵列技术。技术中,用荧光编码微球标记血型抗体,同时用磁珠标记血凝素分子。检测时,在100?l生理盐水中加入5?l荧光编码微球标记抗体、1?l的全血标本以及5?l磁珠标记的血凝素分子;反应后进行磁分离,最后用Luminex荧光编码微球检测仪对上清中的微球进行分类计数,通过比较每种微球的相对数量来判断血型抗原的结果。研究结果磁珠标记的微阵列血型鉴定技术的研究发现,反应中需要保持反应环境的湿润,以含有40%甘油的PBS作为反应介质,能有效避免咖啡环的形成,使C1q分子识别抗原抗体复物的反应能正常进行。以EDAC、NHS做为偶联剂,C1q分子能较好的包被于磁珠表面。当抗体探针浓度在100?g/ml,上样量0.2?l,同时每个样点所需的待测标本量0.2?l时(约105个RBCs)其检测效果较好。磁分离时,磁针长度需要控制在4?6 cm,完成检测需要10~20分钟的反应时间。通过对108个血液标本的分析鉴定,表明A、B、D、M、N五种抗原的敏感度分别为93.18%、83.72%、92.39%、93.24%、90.36%,特异性均为100.00%。荧光编码微球标记的微阵列血型鉴定技术的研究发现,100万个微球与抗体偶联后A、B、D、M、N五种抗体的下降量分别为0.17、0.61、0.40、0.31和0.94?g,对应单个微球表面偶联的抗体分子数量分别约为10万、38万、160万、140万和377万个。反应检测需要将每种荧光微球的数量控制在2000~10000之间,红细胞数量106个左右,对应数量比为1︰100~20,可以在2 min以内完成检测。通过对276例临床标本的A、B、D、M、N血型抗原的分析鉴定,技术的灵敏度与特异性均可达到100%,对长期保存后的血液标本以及1+的弱凝集标本也有同样的检测效果。结论本研究初步建立了两套各具特点的多重血型鉴定技术,其中磁珠标记的微阵列血型鉴定技术可以在一张反应基片上完成单个样本的多个抗原靶标的鉴定,具备方便、快捷、低成本的优势,更能满足溶血或流离血型物质等特殊标本的检测需求。改进后的荧光编码微球标记的微阵列技术,提高了检测的灵敏度与特异性,同时报告多个抗原靶标的鉴定结果,检测速度更加快速,更能满足大样本的检测需求。