研究背景和目的人脑胶质瘤是人类颅内肿瘤中发病率最高的一类肿瘤,其中胶质母细胞瘤是最常见、恶性程度最高的组织学类型。目前治疗脑胶质瘤的方法主要包括了手术切除、放疗和化疗。但是,即使在临床手术技术日益提高的今日,脑胶质瘤患者的预后依然很差。因此,在对人脑胶质瘤的治疗研究中,寻找一种更加有效的治疗方法成为一项刻不容缓的课题。在已经完成的实验研究中,发现胶质瘤细胞的高度增殖能力和侵袭性是导致肿瘤复发和治疗失败的主要原因。尽管人脑胶质瘤很少在全身其他系统中转移,但其细胞对周围组织的浸润和脑组织中较远部位的侵袭是胶质瘤自然病程发展的必然结局。肿瘤细胞为了能够侵入周围组织,必须经历以下几步：从其周围的组织和细胞上脱离下来,穿过基底膜,在细胞外基质中迁移,到达新的组织部位并在此增殖,最终形成新肿瘤。在这一过程中,分解细胞外基质并在其中迁移是一个关键步骤。而基质金属蛋白酶(MMPs)又在分解细胞外基质中的过程中发挥了关键作用。MMPs是一族结构与功能上相关的内肽水解酶类,属于Metzincin超家族,具有分解各种细胞外基质蛋白的能力。在最近的研究中表明,MMPs在多种肿瘤细胞的侵袭和迁移过程中扮演了非常重要的角色,其中MMP-2和MMP-9在人脑胶质瘤侵袭性的相关研究中最受关注。Rho是一种小G结合蛋白,在细胞功能中发挥着多重作用,其中比较重要的一个作用就是维持肌球蛋白丝的收缩功能。这种收缩功能形成了细胞的张力纤维并维持着与细胞间的相互粘附。Rho下游有多种效应蛋白,最重要的是丝氨酸／苏氨酸激酶,即Rho蛋白相关激酶(ROCK)。有研究证实,在人脑胶质母细胞瘤细胞系中(T98G、U251) ROCK呈高表达；在对临床标本的分析研究中,ROCK的表达量与胶质瘤的恶性程度呈正相关。ROCK已经成为胶质瘤分子生物学研究的热点之一,但大多数研究局限于其在细胞骨架结构中的作用及其对人脑胶质瘤细胞迁移的影响。法舒地尔(Fasudil)作为一种特异性的ROCK阻断剂,被证实能够通过改变平滑肌细胞中的肌球蛋白轻链的磷酸化而达到抑制血管痉挛的作用。在临床治疗中被用于控制蛛网膜下腔出血导致的脑血管痉挛以及相关的中枢神经系统缺血症状。在一系列临床前期研究中,Fasudil可能对多种心脑血管疾病有治疗作用,如冠状动脉痉挛引起的心绞痛、高血压、肺动脉高压、脑卒中和心衰等。目前,未见有Fasudil对人脑胶质母细胞瘤作用的的相关研究报道。方法和结果为了阐明Fasudil对胶质母细胞瘤细胞的作用及其内在机制,两种人类胶质母细胞瘤细胞系T98G和U251作为本课题的研究对象。用不同浓度的Fasudil分别处理这两种细胞,并观察由Fasudil引起的细胞生物学特性的变化,包括细胞形态、增殖、侵袭和凋亡等方面。由于假定MMPs在胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭中起到了关键作用,因此检测了Fasudil是否影响MMPs和MMPs的负性调节因子TIMPs的表达。为了进一步探索Fasudil这一已经用于临床治疗的药物在体内是否也发挥了同样的作用,本课题建立了颅内绿色荧光标记的胶质母细胞瘤小鼠动物模型,通过尾静脉给药对体内肿瘤进行处理,将肿瘤组织进行冰冻切片镜下观察并绘制荷瘤鼠生存曲线。一、ROCK抑制剂法舒地尔抑制人脑胶质瘤的体外实验研究1.法舒地尔改变胶质瘤细胞形态用不同浓度的法舒地尔处理T98G和U251细胞后发现,24h后细胞形态改变,细胞突触增多增长且胞体变细。胶质瘤细胞的这种变化表现为法舒地尔的浓度依赖性和时间依赖性。在100μM的高浓度法舒地尔处理组,细胞完全失去正常形态,突触长达胞体的数倍之多。为了验证法舒地尔的这种作用是否为可逆过程,在处理完24h后进行了恢复实验。实验结果显示,经过24h不同浓度法舒地尔处理,低浓度组的胶质瘤细胞在更换全新培养基之后的24h内,恢复了正常的细胞形态；而高浓度组的细胞则无法从拉伸变长、突触增多的星形形态中恢复至正常。2.法舒地尔对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响2.1法舒地尔抑制GBM的迁移损伤修复实验被用来测定胶质瘤细胞的运动迁移能力。用10μL移液器吸头在胶质瘤单细胞层上作出一道划痕,并以不同浓度的法舒地尔及阳性对照进行处理,显微镜下将划痕宽度的变化进行拍照记录。实验结果显示,法舒地尔浓度依赖的抑制了两种胶质瘤细胞的迁移。2.2法舒地尔抑制GBM的侵袭Transwell(?)小室被用来检测胶质瘤细胞在法舒地尔的作用下侵袭能力的变化。经过24h的侵袭,将Transwell(?)小室下表面的已穿膜细胞染色并计数,从而得到胶质瘤细胞相对侵袭力的数据。实验结果显示,法舒地尔能浓度依赖的抑制T98G和U251细胞的侵袭能力。但数据分析发现,法舒地尔对侵袭的抑制作用要高于其对迁移的抑制作用。3.法舒地尔抑制胶质瘤细胞MMP-2的表达RT-PCR法检测法舒地尔对侵袭相关基因转录水平的影响。选择20μM的法舒地尔和siRNA分别处理两种胶质瘤细胞,提取总RNA并进行扩增,结果发现在MMP-2/-9、TIMP1/2/3等侵袭相关基因中,只有MMP-2转录水平发生了变化,且随法舒地尔的浓度升高,MMP-2的转录水平相应降低。之后为了进一步确认法舒地尔对MMP-2的抑制作用,又运用Western Blot和明胶酶谱法从蛋白水平和分泌水平上验证了RT-PCR的结果。4.法舒地尔对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响用[3H]脱氧胸腺嘧啶核苷酸掺入法测定了法舒地尔对胶质瘤细胞增殖的作用。结果发现,法舒地尔在高浓度下处理胶质瘤细胞48h能浓度依赖的抑制T98G和U251细胞的增殖。用流式细胞术检测法舒地尔对胶质瘤细胞早期凋亡率的影响,结果表明在低浓度下法舒地尔在24h的处理后也可以引起细胞的凋亡,且成浓度依赖性。二、ROCK抑制剂法舒地尔抑制人脑胶质瘤的体内实验研究1.建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白eGFP-T98G人脑胶质瘤裸鼠颅内原位移植模型用LipofectamineTM 2000向T98G中转染带有表达eGFP和G418抗性的质粒,G418加压筛选阳性细胞,通过有限稀释法将阳性细胞传代于96孔板中,挑选单克隆细胞株,分离培养并在荧光显微镜下观察鉴定为稳定表达eGFP的T98G细胞系(eGFP-T98G)。细胞传代培养扩增后,选取合适的细胞浓度,用鼠脑立体定向仪将eGFP-T98G细胞悬液种植于裸鼠尾状核。体视荧光显微镜下观察裸鼠移植瘤模型的成瘤情况。2.法舒地尔抑制人脑胶质瘤体内的增殖和侵袭在裸鼠接种成瘤第14天,分别对治疗组和对照组经尾静脉给药(法舒地尔浓度50μg/100μL)。通过大体观察测量、鼠脑冰冻切片和绘制生存曲线等方式检测法舒地尔对人脑胶质瘤体内生长的作用。结果显示,法舒地尔能有效抑制人脑胶质瘤在裸鼠体内的生长和对周围组织的侵袭,接受治疗的裸鼠生存时间较对照组有显著延长。结论在本研究中,我们首先发现并确认Fasudil能够引起人脑胶质瘤细胞的形态学改变,并能降低T98G和U251细胞的迁移和侵袭。但Fasudil对肿瘤细胞的迁移和侵袭抑制作用的强弱并不一致,这种差异引导本课题进行了进一步的研究,即Fasudil对胶质瘤细胞的迁移和侵袭抑制的机制研究。通过一系列的实验我们发现,在常见的肿瘤侵袭相关基因中(MMPs和TIMPs),只有MMP-2的表达能够被Fasudil抑制,这一结果同样在其他的ROCK抑制剂和ROCK-siRNA的阳性对照实验中得到了验证。我们又发现,Fasudil能够明显促进胶质瘤细胞的凋亡,并在高浓度条件下抑制其增殖。通过冰冻切片和生存期曲线等体内实验进一步证明,使用Fasudil阻断ROCK能在体外和体内抑制人脑胶质瘤的恶性进展。因此,我们得到以下结论：Fasudil通过抑制细胞侵袭和促进凋亡降低了人脑胶质瘤的恶性特征; Rho/ROCK信号通路是治疗人脑胶质瘤的有效靶点；对其机制的深入研究有助于发现Fasudil的潜在药理作用,并有可能作为一种已应用于临床的药物成为胶质瘤化学治疗候选药物之一。