黄体酮17α羟基化的生物催化研究

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17α羟基黄体酮(17OHP4)作为重要的甾体激素类药物中间体,其传统的化学合成法成本高、合成途径繁琐,生物合成更加绿色环保逐渐成为研究热点。17OHP4的生物合成主要依赖于17α-羟化酶(CYP17),属于细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 enzymes,CYP450)。为了获得高产量的17OHP4,提高CYP17对黄体酮17位羟化活性和特异性的研究成为急待解决的问题。本实验通过对17α-羟化酶筛选、构建高羟化活性的重组菌株,并研究细胞色素氧化还原酶(CPR)的适配对17α-羟化酶影响,以达到提高17OHP4产率的目的。本实验首先将不同来源的17α-羟化酶基因在酿酒酵母菌株中表达,根据其羟基化产物分析得到高羟化酶特异性的CYP17重组菌。结果显示筛选得到的6种17α羟化酶中,人来源17α羟化酶表现出显著的17α羟基化活性,其转化生成17OHP4的产率达28.5%。其次将h CYP17基因及其突变体A105L克隆到不同的宿主细胞中,通过对转化产物分析,发现h CYP17在酿酒酵母和毕赤酵母中能够催化黄体酮转化为17α-羟基黄体酮,但在大肠杆菌中则并未有蛋白表达。毕赤酵母与酿酒酵母表达体系相比,CYP17及A105L突变体在毕赤酵母中底物转化率更高,产生的副产物种类较少。在酿酒酵母中,A105L突变体重组菌17OHP4产率提高6%,在毕赤酵母中并未体现出产率的显著提高。为进一步提高羟化酶活性,选择将五种不同来源的CPR与h CYP17、A105L共表达,分析不同CPR对人源17α-羟化酶生物催化活性的影响。结果表明在重组酿酒酵母中,五种CPR与h CYP17及突变体A105L共表达菌株都能够增加底物转化率,但主产物生成率较少,更多的生成副产物;在毕赤酵母中,不同来源的CPR均能增加h CYP17的催化活性,同时主产物17OHP4生成率增加,其中h CPR与h CYP17具有更好的适配性,17OHP4的产率提高42%,其他四种来源的CPR(Sc CPR、rat CPR、An CPR、Sg CPR)共表达产率分别提高40%、21%、17.7%、16%。本研究通过改变关键电子传递的氧化还原酶用以提高17α-羟化酶的活性,对于甾体药物的异源表达及工业生产具有应用意义。
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