研究背景:天然免疫系统是宿主防御的第一道防线,可以针对有害刺激进行首次快速反应。免疫细胞通过激活非特异性种系编码的模式识别受体来应对这些威胁。模式识别受体通过识别PAMPs和DAMPs触发下游炎症反应,以消除微生物感染并修复受损的组织。单核吞噬细胞是免疫系统中炎症或免疫耐受的关键指导者,这群免疫细胞存在于人体的多个部位,说明了它们在调控免疫功能中的重要作用。单核细胞具有较强的活动能力和功能性,在与急性或慢性炎症相关的病理状况下,单核细胞迁移到受影响的组织中并分化为组织巨噬细胞。因此,单核细胞和巨噬细胞是宿主防御系统抵抗病原体的关键细胞成分,并且在天然免疫和获得性免疫中均具有重要功能。炎症和组织损伤能够使止血与出血平衡转变为血栓形成和抗纤维蛋白溶解状态,为机体抵御病原体建立了物理屏障,但如果不能及时消除凝血状态,反而会导致消耗性凝血病和弥散性血管内凝血。纤溶酶原是有七个结构域的蛋白,它拥有十几种细胞表面受体,它可以作为配体与其他细胞结合以调节细胞行为,并进一步影响免疫和炎症过程。与其激活为纤溶酶发挥致炎特性相反,纤溶酶原本身还表现出多种抗炎和免疫抑制反应。Siglec是一类可以识别唾液酸结构的凝集素,通过对不同种类唾液酸配体的识别,Siglec可以影响宿主的免疫功能。Siglec-7能够特异性识别α-(2,8)双唾液酸结构,因其胞质内含有ITIM基序而发挥免疫抑制功能。Siglec-7具有高度物种特异性,只有人及少数灵长类动物才具有,其主要表达于单核巨噬细胞和NK细胞上。NLRP3炎性小体是一种介导炎症介质激活的胞质信号复合物,也是细胞应激的关键整合点,可以对各种刺激做出反应,如病毒RNA、溶酶体损伤、细胞外ATP、糖酵解、活性氧、线粒体损伤以及细胞膜对钾离子的通透性改变。NLRP3的强大炎症潜能及其在疾病中的作用使其成为有吸引力的药物靶标。啤酒花作为传统中药材,可以用于治疗焦虑症、失眠症、轻度疼痛和消化不良。啤酒花的这些传统医学价值归因于其提取的多种烯丙基化黄酮类化合物,而黄腐酚是啤酒花中最丰富的烯丙基化黄酮,其含量可高达干重的1%。越来越多的研究发现,Xn毒副作用小且具有广泛的药理学特性,包括抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒和抗真菌活性等。各种内外源刺激导致的炎症激活能感知组织损伤并引起慢性炎症,而许多常见疾病的发病机制正是受组织中炎症因子积累引起的。因此,在某些生理环境下,抵抗炎症带来的机体损伤,恢复组织稳态仍然是人类面临的一项挑战,寻找新的靶标消除这些炎性状态仍然是必要的。作为主要的天然免疫细胞亚群,巨噬细胞是重要的炎症元凶之一,因此调控巨噬细胞及其分泌产物成为我们的研究重点。我们在本论文的两个部分里,分别探讨了人自身分泌的蛋白(纤溶酶原)和植物天然提取物(黄腐酚)负向调控巨噬细胞免疫反应的功能和机制。第一部分,我们首次发现了纤溶酶原可以特异性结合巨噬细胞膜受体Siglec-7,并且纤溶酶原可以通过不依赖于激活纤溶酶的方式介导巨噬细胞的免疫抑制功能。这种生物学意义超出了其作为纤溶系统发挥促进血栓溶解的范畴,对于利用纤溶酶原发挥治疗潜力有一定作用。第二部分,我们研究发现黄腐酚可以通过阻止焦亡小体形成以及抑制线粒体转运的方式抑制了NLRP3炎性小体的组装和活化,我们的结果证明了NLRP3炎性小体是黄腐酚抑制炎症反应的重要通路。第一部分:人纤溶酶原通过Siglec-7负向调节巨噬细胞免疫反应的机制研究研究目的:1.通过分子互作实验明确人Plg和Siglec-7间相互作用的结构位点;2.通过体外使用巨噬细胞炎症模型,研究Plg通过Siglec-7调控巨噬细胞免疫反应的机制。研究方法:1.SPR技术分析蛋白之间的平衡解离常数。2.分子对接技术分析Siglec-7和Plg结合位点。3.构建过表达质粒和突变体用于制备MST样品。4.MST技术分析蛋白之间的相互作用。5.发色底物法测定人Plg催化为纤溶酶的速率。6.病毒感染U-937细胞用于敲低Siglec-7的表达水平。7.巨噬细胞炎症模型:U-937或人外周血来源的单核细胞经PMA诱导成巨噬细胞后常规培养,经LPS和Nigericin引发炎症反应。8.qPCR技术分析巨噬细胞Siglec-7、IL-6、β-actin的mRNA的表达水平。9.Elisa技术分析巨噬细胞培养上清液中IL-6和IL-1β的浓度。10.Plg处理巨噬细胞后用LPS和Nigericin进行刺激,免疫沉淀巨噬细胞中Siglec-7结合的SHP-1的表达水平。11.蛋白免疫印迹分析巨噬细胞蛋白裂解物中Flag、Siglec-7、SHP-1和β-actin等蛋白表达水平。结果:1.SPR结果证实人Plg蛋白和Siglec-7蛋白具有强结合。2.分子对接分析人Plg与Siglec-7具体的结合位点。Siglec-7上的结合位点全部位于胞外段,大部分在V-set结构域中;Plg上的结合位点大部分在kringle3结构域中。3.MST结果证实了人Plg蛋白和Siglec-7蛋白具有强结合;MST结果验证了分子对接的结构位点,分别位于Plg的kringle3结构域和Siglec-7的V-set结构域;MST结果发现Siglec-7结合人Plg不依赖于Plg的α-(2,8)双唾液酸修饰。4.通过构建293T细胞上过表达Siglec-7体系,构建U-937细胞上敲低Siglec-7体系,以及使用Siglec-7与Plg纯品,均证明Siglec-7与Plg的结合不影响Plg的激活速率。5.Plg通过Siglec-7抑制了LPS和Nigericin刺激巨噬细胞引起的IL-6和IL-1β分泌。6.Plg与Siglec-7结合通过募集SHP-1发挥抑制活性。结论:1.人Plg以不依赖α-(2,8)双唾液酸结构的方式特异性结合Siglec-7;2.Siglec-7通过V-set结构域与Plg上的kringle3结构域结合;3.Siglec-7不能抑制或促进Plg激活为纤溶酶;4.Plg通过介导巨噬细胞上膜受体Siglec-7抑制炎性细胞因子产生;5.Plg通过激活Siglec-7胞内的ITIM基序,募集SHP-1发挥抑制活性。第二部分:黄腐酚通过抑制NLRP3炎性小体负向调节巨噬细胞免疫反应的机制研究研究目的:分别通过小鼠骨髓来源巨噬细胞和人单核细胞来源巨噬细胞的NLRP3炎性小体活化模型,1.明确Xn对NLRP3炎性小体的抑制作用;2.研究Xn抑制NLRP3炎性小体活化的机制。研究方法:1.活化NLRP3炎性小体:小鼠骨髓来源的巨噬细胞或人THP-1细胞系诱导成巨噬细胞后常规培养,经LPS和刺激剂(Nigericin、MSU、Alum、R837)诱导NLRP3炎性小体活化。2.蛋白免疫印迹分析巨噬细胞蛋白裂解物中pro-IL-1β、pro-caspase-1、ASC二聚体、ASC单体和β-actin等蛋白表达水平;以及培养上清液中p20蛋白表达水平。3.Elisa分析巨噬细胞培养上清液中IL-1β、IL-18和TNF-α的含量。4.免疫荧光分析细胞荧光蛋白表达等:4.1MitoSOX标记线粒体活性氧,测定细胞内线粒体活性氧的水平;4.2MitotrackerDeepRed标记BMDM细胞线粒体膜电位,测定细胞内线粒体膜电位变化;4.3TOM20标记线粒体,α-tubulin标记细胞微管,测定线粒体在细胞内的定位和形态;4.4ASC免疫荧光抗体标记ASC蛋白,测定ASC二聚体的表达情况。5.乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)释放法检测巨噬细胞培养上清中Xn对NLRP3活化引起的细胞焦亡影响。6.NAD/NADH定量测定细胞内NAD 水平,分析实验不同组细胞NAD 水平的相对浓度。结果:1.运用小鼠BMDMs实验模型,在LPS启动NLRP3炎性小体第一信号之前用Xn处理细胞。免疫印迹结果显示,Xn剂量依赖性地抑制pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化和IL-1β的分泌;ELISA结果显示,Xn剂量依赖性地抑制IL-1β、IL-18、TNF-α的分泌。2.运用小鼠BMDMs实验模型,在LPS启动NLRP3炎性小体第一信号之后用Xn处理细胞,最后用Nigericin活化炎性小体。免疫印迹结果显示,Xn依赖性地抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌;ELISA结果显示,Xn剂量依赖性地抑制IL-1β、IL-18分泌,而对TNF-α的分泌无影响。3.运用不同类型的刺激剂活化小鼠BMDMs的NLRP3炎性小体,免疫印迹和Elisa结果分别显示,Xn下调了caspase-1的活化和IL-1β的分泌;运用THP1细胞诱导为巨噬细胞的NLRP3炎性小体活化实验模型,Elisa结果显示,与小鼠骨髓巨噬细胞的实验结果一致,Xn同样可以抑制人来源的巨噬细胞IL-1β的分泌。4.Xn在抑制Nigericin或MSU诱导的NLRP3炎性小体的活化过程中,免疫荧光结果显示,Xn可减少mtROS的生成,但降低了线粒体的膜电位;NAD/NADH定量结果同样发现Xn不能逆转线粒体的损伤。5.在Nigericin诱导的NLRP3炎性小体活化BMDMs模型中,免疫荧光结果显示Xn阻止了Nigericin诱导的线粒体到核周区域的转运,而且这种微管驱动的线粒体空间定位的阻滞过程并不依赖微管的乙酰化。6.免疫印迹显示Xn减少了NLRP3炎性小体组装过程中ASC二聚体的形成,免疫荧光结果同样发现ASC斑点明显减少。结论:1.Xn可抑制NLRP3炎性小体的启动与组装活化过程;2.Xn通过阻滞受损线粒体的空间定位、减少ASC二聚体的形成等机制,抑制NLRP3炎性小体活化。