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灰葡萄孢(Botrytis cinerea)是引起植物灰霉病的一种重要的植物病原真菌,其寄主范围广泛,常给农业生产造成严重的经济损失。挖掘植物抗灰葡萄孢的相关基因,探究其抗病的分子机制,为阐明植物与灰葡萄孢互作的分子机理及灰霉病的防治奠定基础。实验室前期研究获得了拟南芥抗灰葡萄孢相关基因SDR6,明确了SDR6基因参与拟南芥对灰葡萄孢和Pst DC3000(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)的抗性。本研究对SDR6基因与SA、JA信号途径的关系进行分析;检测SDR6基因调控拟南芥抗灰葡萄孢和Pst DC3000的机制;通过酵母双杂交技术、双分子荧光互补技术,鉴定SDR6的候选互作蛋白。研究结果为进一步阐明拟南芥SDR6基因调控拟南芥抗病的分子机制奠定基础。1.利用RT-qPCR技术,检测SA、BTH、ACC、MeJA处理拟南芥野生型Col-0和SA、JA/ET信号途径突变体中SDR6基因的表达情况,分析SDR6基因与SA、JA/ET信号途径的关系。结果发现,野生型中,SA、BTH和MeJA处理对SDR6基因的表达均有诱导作用;SA信号途径突变体eds5、sid2和NahG中的SDR6基因在SA处理后,表达水平显著高于野生型,其中突变体eds5在SA和BTH处理后,SDR6基因的表达水平极显著高于野生型。ein2突变体用ACC处理3 h或eto1突变体用ACC处理12h,SDR6基因的表达水平都显著高于野生型。MeJA处理24 h,突变体jar1中SDR6基因的表达水平显著高于野生型。表明SDR6基因的表达受SA、JA/ET信号途径的调控。2.检测拟南芥野生型Col-0、突变体sdr6、回复突变体CE、突变体NahG、eds5、jar1以及双突变体sdr6/NahG、sdr6/eds5及sdr6/jar1对灰葡萄孢B.cinerea的抗性。结果发现,拟南芥野生型Col-0和SDR6基因的回复突变体CE均表现出明显的抗病症状,而其它突变体均表现出明显的感病症状。双突变体sdr6/NahG、sdr6/eds5及sdr6/jar1病斑面积均明显大于其相应的各个单突变体sdr6、NahG、eds5、jar1。利用台盼蓝和DAB染色方法,对突变体接种叶片进行组织病理学,同时进行灰葡萄孢BcACTIN基因的分析,结果与突变体的症状相一致,说明突变体sdr6对灰葡萄孢敏感,双突变体sdr6/NahG、sdr6/eds5及sdr6/jar1对灰葡萄孢的敏感性均高于其相应的各个单突变体,表明SDR6基因正调控拟南芥对灰葡萄孢的抗性。利用RT-qPCR技术,检测各植株接种灰葡萄孢后抗病相关基因ICS1、JAR1、PDF1.2、PR1的表达情况。结果发现,突变体sdr6中ICS1、JAR1、PR1基因的表达水平明显低于在拟南芥野生型Col-0和回复突变体CE,突变体sdr6中PDF1.2基因的表达水平明显高于在拟南芥野生型Col-0和回复突变体CE。表明SDR6基因通过影响ICS1、JAR1、PR1、PDF1.2基因的表达影响拟南芥对灰葡萄孢的抗病性。3.检测拟南芥野生型Col-0、突变体sdr6、回复突变体CE、突变体NahG、eds5、jar1以及双突变体sdr6/NahG、sdr6/eds5及sdr6/jar1对Pst DC3000的抗性。结果发现,与拟南芥野生型Col-0和回复突变体CE相比,突变体sdr6对Pst DC3000表现抗病症状,突变体jar1、eds5、NahG对Pst DC3000表现比较敏感,双突变体sdr6/NahG、sdr6/eds5及sdr6/jar1对Pst DC3000的敏感性均强于相应的各个单突变体。组织病理学检测及接种叶片中病菌含量的检测均与突变体接种症状相一致。表明表明SDR6基因负调控拟南芥对Pst DC3000的抗性。利用RT-qPCR技术,检测各植株接种Pst DC3000后抗病相关基因ICS1、JAR1、PR1、PDF1.2的表达情况。结果发现,突变体sdr6中ICS1、JAR1、PR1基因的表达水平明显高于在拟南芥野生型Col-0和回复突变体CE,突变体sdr6中PDF1.2基因的表达水平明显低于在拟南芥野生型Col-0和回复突变体CE。表明SDR6基因通过影响ICS1、JAR1、PR1、PDF1.2基因的表达影响拟南芥对Pst DC3000的抗病性。4.利用酵母双杂交技术,鉴定SDR6的候选互作蛋白。结果发现,与阴性对照相比,共转化AD-SDR6+BD-AT1G06050、BD-SDR6+AD-AT1G06050、AD-S DR6+BD-AT1G21400、BD-SDR6+AD-AT1G21400、AD-SDR6+BD-AT2G19480和BD-SDR6+AD-AT2G19480组合的酵母菌落在三缺培养基(-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His/3-AT)和四缺培养基(-Leu/-Trp/-His/-Ade)上均能正常生长,表明SDR6与AT1G06050、AT1G21400、AT2G1948能在酵母细胞中直接互作。利用GFP在烟草细胞中的瞬时表达技术,对AT1G06050、AT1G21400和A T2G19480基因进行了亚细胞定位分析,结果发现,AT1G06050基因定位于细胞核、AT1G21400定位于细胞膜、AT2G19480定位于细胞膜。利用双分子荧光互补技术,鉴定SDR6的候选互作蛋白。结果发现,共注射SDR6-nYFP与AT1G06050-cYFP、SDR6-cYFP与AT1G06050-nYFP、SDR6-nYF P与AT1G21400-cYFP、SDR6-cYFP与AT1G21400-nYFP、SDR6-nYFP与AT2G19480-cYFP、SDR6-cYFP与AT2G19480-nYFP组合的烟草叶片中均出现荧光信号,而其它阴性对照均未检测到荧光信号。表明SDR6与AT1G06050、AT1G21400、AT2G19480能在烟草细胞中直接互作。