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第一部分:不同精子DNA碎片率患者精浆小RNA表达谱分析研究目的:了解不同精子DNA碎片率男性患者精浆小RNA（miRNA）表达差异,探索特发性男性不育诊断的生物标志物。材料与方法:1、从男性不育门诊,收集来自5个精液常规检查正常的男性患者前后两次不同精子DNA碎片（SDF）值的10份精液样本（每一对精液样本来自同一患者）,通过高速离心分离得到精浆样本。然后采用Agilent 2000高通量测序平台,对这10份精浆样本行小RNA表达谱检测,并使用GO富集分析等方法进行生物信息学分析,筛选出差异表达的miRNA。2.继续从不育门诊收集精液常规检查正常的男性患者精液样本,行流式SCSA法检测精子SDF,根据SDF值,将样本分为3组,即SDF≤15%组,15%＜SDF＜30%组和SDF≥30%组。3.以miRNA表达谱检测筛选出的差异显著、表达量丰富的精浆miRNA为靶标,采用RT-q PCR方法,对上述三组患者的精浆样本进行大样本量的两个阶段验证。结果:1.精浆样本miRNA表达谱测序共检测到897个miRNA,发现431个差异表达miRNA,其中14个在所有样本中均存有差异表达。以P＜0.05为差异显著性标准,根据log2-foldchange值和表达量,筛选发现miR-374b-5p、miR-429、miR-26b-5p、miR-21-5p、miR-4257、miR-135b-5p和miR-134-5p等7个具有统计学显著性差异的miRNA。2.第一阶段验证:36份精浆样本（每组12份）,7个miRNA的RT-q PCR验证发现,miR-374b-5p和miR-26b-5p的表达在SDF≤15%、15%＜SDF＜30%和SDF≥30%三组患者精浆样本中均存在显著差异。而miR-429、miR-21-5p、miR-4257、miR-135b-5p和miR-134-5p在三组间的表达水平无明显差异。3.第二阶段验证,以第一阶段验证发现存在差异表达的miR-374b-5p和miR-26b-5p为靶标,对54份不育患者的精浆样本（18份每组）行RT-q PCR验证,结果发现miR-374b-5-p和miR-26b-5p的表达水平在三组间仍存在显著性差异。4.总和两个阶段的共计90份男性患者的三组（30份每组）精浆样本统计发现:miR-374b-5p和miR-26b-5p在SDF≤15%、15%＜SDF＜30%和SDF≥30%三组精浆样本中的表达水平存在显著差异,且miR-374b-5p和miR-26b-5p在SDF≤15%组的表达水平,明显低于15%＜SDF＜30%组和SDF≥30%组。结论:不育门诊精液常规检查正常、SDF不同的男性患者精浆中,可能存在特异miRNA表达谱。miR-374b-5p和miR-26b-5p表达水平的显著降低与SDF值升高存在联系,miR-374b-5p和miR-26b-5p在精浆中的差异表达可为特发性男性不育研究提供一定的线索。第二部分:miR-374b-5p和miR-26b-5p在男性精子中的表达及其与IVF胚胎质量的相关性研究研究目的:分析精子miR-374b-5p和miR-26b-5p表达水平对常规体外受精（IVF）胚胎质量的影响。材料和方法:1.本研究共纳入64对行常规IVF治疗的夫妇。收集男方精液样本,采用Isolate梯度离心法分离得到精子,并收集患者的临床资料。根据Day3胚胎的优胚率（rate of good quality embryo,GQE）,将精子样本分成两组:高优胚率（H-GQE,GQE≥75%）组和低优胚率（L-GQE,GQE＜75%）组,通过RT-q PCR方法,检测miR-374b-5p和miR-26b-5p在两组精子样本中的表达情况。2.结合临床数据,采用ROC曲线和logistic回归分析,分析miR-374b-5p和miR-26b-5p的相对表达量与GQE之间的关系。结果:1.精子miR-26b-5p在H-GQE组的表达水平明显低于L-GQE组（P＜0.0001）,而miR-374b-5p的表达水平在两组之间无明显差异（P=0.2143）。2.对miR-26b-5p的相对表达量和优胚率行ROC曲线分析,显示曲线下面积AUC为0.824。通过计算cutoff值,得到敏感度和特异度分别为0.750和0.812,这表明miR-26b-5p相对表达量对鉴别Day3胚胎的优劣性具有一定的应用价值。3.Logistic回归分析显示,miR-26b-5p相对表达量与GQE之间存在显著相关性（优势比为0.059,95%置信区间:0.012-0.291,P＜0.0001）。校准男女双方年龄,身体质量指数（body mass index,BMI）,精子浓度,精子前向运动（PR）百分比,基础内分泌指标,获卵数,MII卵数,2PN及受精率之后,我们发现miR-26b-5p相对表达量与GQE之间仍有显著的相关性（优势比为0.036,95%CI:0.002-0.562,P=0.018）。结论:精子miR-26b-5p表达可影响优质胚胎生成,精子miR-26b-5p表达水平可作为评估IVF胚胎质量的一个指标,为特发性不育男性的生物学背景研究提供新的方向。第三部分:miR-26b-5p在小鼠生精细胞GC-1 spg和GC-2 spd中的功能及相关机制研究研究目的:利用生精细胞模型GC-1 spg和GC-2 spd细胞株,探索miR-26b-5p在生精过程中的作用,从而阐明miR-26b-5p与精子DNA碎片发生之间的分子病理机制。材料和方法:培养小鼠精原细胞株（GC-1 spg）和小鼠精母细胞株（GC-2 spd）,通过转染miR-26b-5p的mimic质粒,干扰细胞内miR-26b-5p的表达,从而构建过表达miR-26b-5p组（miR-26b-5p组）和过表达阴性对照组（mimic-NC组）。转染72 h后收集2组细胞,用RT-q PCR方法检测miR-26b-5p的表达水平来验证转染效率,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖曲线,流式细胞技术检测细胞凋亡,用Western blotting法检测凋亡增殖相关蛋白Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2,并同时检测细胞内线粒体DNA拷贝数和ATP水平,最后检测相关细胞通路探索可能的作用机制。结果:1.转染miR-26b-5p mimic过表达miR-26b-5p后,细胞凋亡增加,增殖减少,同时Western blotting显示cleaved Caspase-3和bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达水平下降。2.过表达miR-26b-5p后,细胞内线粒体ATP含量下降,线粒体DNA拷贝数减少。与结果1中过表达miR-26b-5p后细胞凋亡增殖情况相吻合。3、细胞通路相关蛋白检测发现,过表达miR-26b-5p后,p-ERK/t ERK比值升高,p53表达水平也显著升高。但AKT,p AKT、PI3K和p-PI3K等蛋白表达水平在两组间无显著性差异改变。结论:1、过表达miR-26b-5p,抑制小鼠生精细胞的增殖能力,并促进细胞凋亡。2、miR-26b-5p可能通过miR-26b-5p可能通过影响线粒体功能促进细胞的凋亡,损伤精子DNA,导致精子DNA碎片化生成。3、miR-26b-5p可能通过MAPK信号通路和p53信号通路影响细胞活性和凋亡。