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目的：
利用MicroRNA基因芯片技术,探讨MicroRNA在外阴鳞状细胞癌组织中的表达情况及其临床意义。
材料与方法：
一、材料
选择中国医科大学附属盛京医院妇产科2010年3月至12月诊断为外阴鳞状细胞癌并行手术治疗的3例患者的外阴癌新鲜组织做为病例组,病例组患者癌旁阴性切缘组织作为对照组。
二、主要试剂
主要试剂及仪器:RNA抽提剂:TRIzol(Invitrogen)和miRNeasyminikit;nanodrop分光光度计;凝胶电泳;miRCURYTMArrayPower标记试剂盒;芯片miRCURYTMLNAArray(v.16.0)(Exiqon);GenePix4000B芯片扫描仪。
三、方法
RNA抽提使用RNA抽提剂TRIzol(Invitrogen)和miRNeasyminikit(QIAGEN)进行样品RNA抽提,有效地恢复所有RNA物种,包括miRNAs.使用nanodrop分光光度计进行RNA的质量检测,用凝胶电泳检测RNA的纯度及完整性。
RNA标记RNA分离以后,采用miRCURYTMArrayPower标记试剂盒,用标记酶将Hy3TM或Hy5TM荧光基团标记miRNA。
芯片杂交标记完成后,将标记好的探针和miRCURTM芯片(由Exqion公司提供的第六代miRCURYTM芯片,包括多达1891个探针,涵盖所有miRBase16.0收录的人类、大鼠、小鼠的miRNA,除此之外,该芯片还包含了miRBase16.0没有记载的66个miRNA)杂交,使用GenePix4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度。
四、统计学分析
使用GenePix4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果转换成数字型数据,扫描的图像输入到GenePixPro6.0software(Axon)进行栅极调整和数据分析。选择均一化后miRNA和强度＞=50的miRNA,计算归一化因子。用中位数法标准化,标准化后,差异表达的miRNA通过ScatterPlot、VolcanoPlot、MEV(v4.6,TIGR)等软件对数据进行分析,得出结论
结果：
共鉴定出430+miRNA差异表达,发现42个miRNA表达差异具有统计学意义(P＜0.05),其中20个miRNA表达上调,22个miRNA表达下调。
结论：
外阴鳞状细胞癌组织中miRNA表达存在明显差异,其中miRNA(miR-99b、miR-211、miR-21、has-miRPlus-D1058)的差异表达可能成为评估外阴癌发病风险的参考指标。