在卵巢癌的药物治疗中,化疗耐药仍然是困扰抗肿瘤治疗的瓶颈问题之一。人们期待分子靶向药物的发现为克服肿瘤耐药提供新的可能。目前认为,抑制PI3K/AKT/mTOR通路一方面拮抗促存活,另外又发现抑制PI3K/AKT/mTOR通路还可以直接磷酸化Bax、Bim等蛋白引起蛋白构象改变而发挥促凋亡作用。由于PI3K/AKT/mTOR通路关键分子间存在交叉调控机制,导致单独靶向PI3K或mTOR的抑制剂抗肿瘤效果不佳。为了增加靶向PI3K/AKT/mTOR通路的抗肿瘤效果,又研发了 PI3K/mTOR的双靶向抑制剂,在一些肿瘤中具有更强的抗肿瘤效果。因此,利用PI3K/mTOR的双靶向抑制剂,通过探讨抑制PI3K/AKT/mTOR凋亡相关蛋白的作用,可能为逆转化疗耐药提供新的线索。随着研究的深入,已经发现抑制PI3K/mTOR可以诱导自噬,但自噬发挥的作用及其机制尚不清楚。目前已经发现,mTOR的下游底物ULK1等激酶可以磷酸化p62,进而促进p62的泛素相关结构域(UBA)与底物蛋白结合,实现其对特定底物蛋白的自噬降解途径的精准调控,决定了自噬的作用。以往的实验已经发现通过蛋白酶体途径能够降解抗凋亡蛋白Mcl-1,而对于自噬是否参与Mcl-1的降解尚不清楚。而作为自噬受体的多功能枢纽蛋白p62/SQSTM1在自噬降解蛋白过程中发挥重要作用,而多种激酶对p62/SQSTM1磷酸化作用能够更加精细调控与降解底物蛋白的结合,从而决定了细胞自噬在细胞凋亡等过程中的作用。因此,探讨作为自噬受体的多功能枢纽蛋白p62/SQSTM1在双靶向抑制PI3K/mTOR诱导的自噬降解Mcl-1等抗凋亡蛋白促进细胞凋亡的作用,可能为提高靶向PI3K/mTOR通路的抗肿瘤药物作用提供新的理论支撑。在本研究中,以PIK3CA基因突变且对顺铂敏感性不同的卵巢癌细胞为研究对象,通过双靶向抑制PI3K/mTOR途径,研究p62磷酸化调控的自噬对抗凋亡蛋白Mcl-1的降解,探讨抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导线粒体途径凋亡的机制,为分子靶向逆转卵巢癌耐药提供实验依据。方法:(1)基因测序并分析人浆液性上皮性卵巢癌SKOV3及A2780细胞PIK3CA基因的突变位点。(2)MTT法检测单、双靶向PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂对卵巢癌SKOV3及A2780细胞生存率的影响;检测PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402联合顺铂对SKOV3和A2780细胞生存率的影响;CompuSyn软件分析PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402联合顺铂对SKOV3和A2780细胞的协同效应。(3)检测单、双靶向PI3K/mTOR抑制剂对PI3K/AKT/mTOR信号通路活性及卵巢癌细胞凋亡的影响。Western blot法检测单、双靶向PI3K/mTOR抑制剂对信号通路关键下游分子p-AKT、p-p70s6k、p-4EBP1表达的影响;检测Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9及Bcl-2家族蛋白的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率。(4)检测单、双靶向PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂对SKOV3细胞线粒体功能影响;JC-1染色检测细胞线粒体膜电位;DCFH-DA染色检测细胞内ROS水平;Mitosox染色观察线粒体内ROS水平;ATP试剂盒检测细胞内ATP相对含量。(5)分离卵巢癌细胞线粒体,检测单、双靶向PI3K/mTOR抑制剂对线粒体Mcl-1、Bak等蛋白表达的影响。Western blot法检测PI3K/mTOR双靶向抑制剂单独或联合顺铂处理SKOV3细胞引起Mcl-1蛋白的表达变化。(6)检测单、双靶向PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂对SKOV3细胞自噬流量的影响。检测p62、LC3等自噬相关蛋白表达变化的影响,以及使用溶酶体抑制剂氯喹干扰溶酶体降解功能后,观察p62、LC3II/I蛋白表达。阻断自噬或蛋白酶体降解途径,检测Mcl-1蛋白的表达变化。(7)间接免疫荧光法检测p62蛋白与Mcl-1蛋白的共定位。利用p62 UBA结构域截短突变的质粒转染细胞,间接免疫共沉淀法检测p62通过泛素相关结构域(UBA)与Mcl-1蛋白的结合情况。(8)使用特异性p-p62(Ser403)抗体,western blot法检测PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402对SKOV3细胞p62 Ser403位点磷酸化水平的影响。利用p62 Ser403位点磷酸化失活突变的质粒转染细胞,免疫共沉淀法观察p62与Mcl-1的结合;MTT法观察细胞生存率变化。结果:(1)人浆液性上皮性卵巢癌SKOV3细胞突变位点为H1047R(A→G),位于编码蛋白的激酶结构域,A2780细胞突变位点为E365K(G→A),位于编码蛋白的C2结构域,两个结构域的功能不同。(2)MTT结果显示,PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402能够降低SKOV3细胞及A2780细胞生存率。CompuSyn软件分析PKI-402与顺铂的协同效应,在卵巢癌耐药细胞系SKOV3中,PI3K/mTOR双向抑制剂PKI-402与顺铂产生协同效应(CI:0.41),在卵巢癌敏感细胞系A2780细胞中,PI3K/mTOR双向抑制剂PKI-402与顺铂没有显著的协同效应(CI:0.99),这可能与两种细胞PIK3CA基因的突变位点不同有关。(3)PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402与单靶向抑制剂相比,显著降低p-AKT、p-p70s6k、p-4EBP1表达水平,抑制卵巢癌细胞存活和细胞克隆形成,提高 Bax/Bcl-2 蛋白比率,增加凋亡蛋白 Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9 表达水平,诱导SKOV3细胞发生凋亡。(4)PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402与单靶向抑制剂相比,能够显著降低线粒体膜电位,增加线粒体内及细胞内ROS水平,降低细胞内ATP相对含量,提示PKI-402引起线粒体功能受损。(5)PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402使SKOV3细胞中Mcl-1蛋白的表达呈时间依赖性下降。与单独使用顺铂处理相比,PKI-402联合顺铂能更显著降低SKOV3细胞Mcl-1蛋白的表达;细胞线粒体中Bak/Mcl-1比例增加,提示PKI-402通过降低抗凋亡蛋白Mcl-1的表达诱导SKOV3细胞发生凋亡。(6)PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402诱导SKOV3细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比例增加,p62蛋白表达快速增加后随自噬发生逐渐降低。应用溶酶体抑制剂CQ与PKI-402联合处理细胞后,LC3Ⅱ/Ⅰ比例及p62蛋白的表达均较单独使用PKI-402 处理细胞后增加。当干扰蛋白酶体及溶酶体功能后,均引起 Mcl-1 蛋白的表达较对照组有所增多,提示PKI-402能够通过自噬途径和蛋白酶体途径降解Mcl-1。(7)免疫荧光检测结果显示,PI3K/mTOR双向抑制剂PKI-402引起SKOV3细胞p62及Mcl-1共定位于细胞核周围;分别抑制自噬和蛋白酶体途径,p62与Mcl-1点状聚集增多且二者存在共定位现象。在转染p62蛋白UBA结构域截短突变质粒的细胞中,Mcl-1与p62蛋白的结合显著下降,说明p62通过UBA结构域与Mcl-1结合进而通过自噬和蛋白酶体途径降解。(8)PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402可以增加p62 Ser403位点磷酸化水平,随药物处理时间延长,自噬水平增高,p62Ser403位点磷酸化水平下降。在转染p62蛋白Ser403位点磷酸化失活突变质粒的细胞中,p62与Mcl-1的结合能力下降,细胞生存率部分增加,提示PKI-402可以通过促进p62Ser403位点磷酸化从而提高p62与Mcl-1的结合能力。结论:(1)PIK3CA基因1047位点A→G突变(编码PI3Kα亚基的激酶结构域)的卵巢癌SKOV3细胞对PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402更加敏感。(2)PI3K/mTOR双向抑制剂PKI-402可以更有效抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活性,促进卵巢癌细胞凋亡。(3)当PI3K/mTOR同时被抑制时,自噬起始复合物关键激酶ULK1被激活,自噬流量增强,同时促进p62蛋白S403位点磷酸化,导致抗凋亡蛋白Mcl-1降解是双靶向抑制PI3K/mTOR诱导细胞凋亡的机制之一。综上,本研究发现PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402通过改变多功能蛋白p62 Ser403磷酸化水平,调节自噬降解Mcl-1蛋白,诱导线粒体途径凋亡并增加耐药细胞对顺铂敏感性。这为临床上针对顺铂耐药,且存在卵巢癌PI3K/AKT/mTOR信号通路突变患者的治疗带来了曙光,为靶向药物的开发提供了新的方向。