论文部分内容阅读
鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是水产养殖中常见的条件致病菌之一,广泛存在于海洋环境中,可感染鱼、虾、贝等多种水产动物,引起的出血性败血症对水产养殖业造成重大经济损失。VI型分泌系统（Type VI secretion system,T6SS）广泛分布于革兰氏阴性细菌中,具有提高病原菌的毒力、种间或种内竞争、与宿主互惠共生、应对外界环境变化等功能。我们在前期研究中发现鳗弧菌M3株的T6SS不表达,即使改变多种培养条件和环境因子也未能激活T6SS。为了寻找影响鳗弧菌T6SS表达的因子,本文分析了几种抗生素对M3 T6SS表达的影响,并构建M3突变体库来筛选影响T6SS表达的因子。但是这两种方法均未能成功筛选到激活M3 T6SS的因子。于是基于该突变文库,开展了影响鳗弧菌几种毒力表型的基因的筛选。具体研究内容如下:1.抗生素对鳗弧菌M3和MHK3T6SS表达的影响。鳗弧菌MHK3的T6SS处于激活状态,特征为能够表达和分泌溶血素共调节蛋白（hemolysin co-regulated protein,Hcp）,用作阳性对照菌株。本研究构建了鳗弧菌融合菌株M3 lacZ::T6SS和MHK3 lacZ::T6SS,在抗生素胁迫下检测鳗弧菌T6SS的表达变化。结果显示,在不同浓度的四环素、链霉素、罗红霉素、多粘菌素的作用下,鳗弧菌MHK3的生长在对数生长期受到抑制（p<0.05）,但在平台生长期恢复了正常生长（p>0.05）;与此同时,在整个生长期间,鳗弧菌T6SS的表达均受到显著性抑制（p<0.05）。鳗弧菌M3在抗生素的胁迫下T6SS依旧未检测到表达。这些结果表明四环素、链霉素、罗红霉素、多粘菌素等抗生素的作用可以降低鳗弧菌MHK3 T6SS的表达,但不能诱导M3 T6SS的表达。2.鳗弧菌M3转座子突变体文库的构建和Hcp表达菌株的筛选。使用转座子mini-Tn10（pLOF/Kana）,利用电激转化和细菌结合的方法,构建了鳗弧菌M3菌株转座子突变体文库,共得到突变株1152株。利用RT-PCR和Westernblot的方法检测突变文库菌株hcp基因的转录和表达情况。研究结果显示,筛选到1株突变株2B5的hcp基因转录水平比野生型M3菌株提高40倍,但未能检测到该突变株表达Hcp蛋白。3.鳗弧菌M3毒力相关表型发生变化的突变株及基因的筛选。对M3突变体文库的1152株菌进行筛选,得到泳动、酪蛋白酶活性、明胶酶活性、菌膜形成能力发生明显变化的突变株1株（菌株6G1）、3株（5A11,7B12,7E12,）、1株（7H1）、3株（5E2、6A2、6E12）。进一步分析显示,一个磷酸二酯酶相关基因的突变引起泳动能力增强（P<0.05）,leuD、rseB和thiQ的突变引起酪蛋白酶活性明显减弱（P<0.05）,potD的突变引起明胶蛋白酶活性显著减弱（P<0.05）,leuO、ilvH和grpB的突变引起菌膜形成能力明显减弱（P<0.05）。综上所述,本研究从环境和基因水平未能找到激活鳗弧菌M3 T6SS的因子,找到8个影响鳗弧菌M3运动、蛋白酶活性、菌膜形成等毒力相关的基因,为进一步研究鳗弧菌的致病机制奠定了基础。