论文部分内容阅读
背景：Jennings于1960年首先提出缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)的概念：即缺血器官、组织重新获得血液供应后不仅不能使组织、器官功能恢复,反而加重了功能代谢障碍及结构破坏,这种现象称之为IRI。同其它器官一样,肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI)常造成严重并发症,其原因与多种临床及环境因素有关。临床上HIRI是肝脏外科中普遍存在的现象,如肝移植、肝叶切除术、出血性休克等。IRI主要来源于再灌注时产生的急性活性氧,它会导致直接的组织损伤,并启动一连串的导致炎症、细胞死亡甚至器官衰竭的有害细胞反应。HIRI可分为肝脏热IRI和冷IRI两类,IRI时肝脏和胆道系统均造成不同程度的损伤,而胆道系统对IRI较肝实质更敏感,胆道是热IRI、冷IRI所致损伤的重要靶器官,其损伤主要机制可能包括：自由基介导的损伤,三磷腺苷(ATP)的消耗,钙超载,微循环障碍,疏水性胆汁酸盐的破坏作用,以及细胞骨架的损伤等。其中热IRI对胆管周围血管丛的影响较大,热IRI后,血管内炎症细胞的聚集,血管内皮细胞坏死,血管内膜损伤,血管收缩等多种因素导致胆管周围血管丛的破坏,胆道的狭窄,从而加剧胆道系统的损伤。临床上常常导致胆汁淤积,术后高胆红素血症,移植肝无功能等后果,增加临床治疗的难度。因此胆管周围血管丛损伤后的再生对肝脏手术后患者的康复有着非常重要的作用。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)是血红素降解的催化酶,促进血红素在体内分解为一氧化碳(CO)、胆绿素(biliverdin)和铁。现已发现HO-1系统主要有抗氧化、抗炎、维持微循环、调节细胞周期四大作用,HO-1的过表达能诱导血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)表达增加,增强血管损伤后的修复能力,从而促进血管内皮的再生。但是在胆道系统IRI后它能否促进胆管周围小血管的再生,尚需进一步研究。本实验采用大鼠HIRI模型,探讨血红素氧合酶-1在减轻胆道IRI中的作用及可能机制,观察其能否促进胆道系统IRI后胆管周围血管丛再生,改善胆道血供,减轻胆道损伤。为肝移植或肝脏手术后胆道并发症的诊治提供理论基础和实验依据。目的：建立大鼠肝脏热缺血在灌注损伤模型,探讨胆道热缺血再灌注损伤后血红素氧合酶-1对胆管周围小血管再生的作用及可能机制。为临床肝脏术后胆道缺血再灌注损伤并发症的治疗提供理论基础和实验依据。材料与方法：1.动物分组：将128只成年大鼠随机分为四组：①生理盐水对照组(即NS组),将大鼠麻醉后,在阴部背静脉注入0.5ml生理盐水。②空白腺病毒对照组(即Ad组),即在大鼠阴部背静脉注入稀释到0.5ml生理盐水中的空白腺病毒③腺病毒转染HO-1组(即HO-1组),即在大鼠阴部背静脉注射稀释到0.5ml生理盐水中剂量为携带转染2×105TU HO-1基因的腺病毒。④siRNA组,即在大鼠阴部背静脉注入稀释到0.5ml生理盐水中的剂量为2×105TU的siRNA。不同时间点取相应大鼠肝脏组织,及肝门部胆管组织。2.肝脏热缺血再灌注损伤病理模型的建立：参考FeiX[20]等建立的大鼠缺血再灌注损伤模型,选用清洁级健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,体重200-250g,阻断大鼠肝脏左叶和中叶的肝动脉和门静脉,45分钟后松开血管夹,关闭腹腔。3.标本采集：再灌注后分别于1小时(h)、24小时(h)、7天(d)、14天(d)时相点随机选取8只大鼠,收集外周循环血液5ml,用生理盐水沿门静脉注入冲洗肝脏,待肝脏呈土黄色后,迅速取下再灌注损伤后的肝叶。4.指标检测：取各组大鼠再灌注损伤后的肝脏组织1)TUNEL肝细胞凋亡检测,观察热缺血再灌注损伤中肝细胞凋亡指数；2)Western blot检测血管内皮生长因子A(VEGF-A),观察血管再生相关蛋白在肝脏中的表达；3)取肝脏和肝门部胆管组织(7天和14天)进行双重免疫荧光标记von Willebrandfactor(vWF)和a-smooth muscle actin(a-SMA),比较胆管周围小血管的再生；4)流式细胞术检测循环中和肝脏组织中内皮祖细胞的分布。结果1.TUNEL肝细胞凋亡指数检测显示：相同时相点HO-1组肝细胞凋亡指数明显低于NS组、Ad组、siRNA组(P<0.05)；相同相间点siRNA组肝细胞凋亡指数明显高于其它三组(P<0.05)；NS组和Ad组组间差异无统计学意义(P>0.05)。2.Western Blotting检测结果显示：同时相点相比,HO-1组VEGF表达较明显；siRNA组VEGF表达不明显；NS组和Ad两组间无显著差异。3.免疫荧光双染显示：相同时相点H0-1组肝脏和胆管周围小血管数量明显高于其它三组(P<0.05)；siRNA组小血管数量较其它三组少(P<0.05)；NS组和Ad组组间差异无统计学意义(P>0.05)。4.流式细胞仪检测结果显示：相同时相点HO-1组肝脏和血液中EPCs的含量明显高于其他三组<0.05)；siRNA组肝脏和血液中EPCs的含量明显低于其它三组(P<0.05);NS组和Ad组组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.Fei X[20]等建立的大鼠肝脏热缺血模型是一种稳定、可靠、简便、可操作性强的模型。2.HO-1在肝脏热缺血再灌注损伤后,能减轻大鼠肝细胞凋亡；HO-1诱导血管内皮生长因子及内皮祖细胞的表达,促进血管内膜的修复及胆管周围小血管的再生。因此HO-1在肝脏缺血再灌注损伤中具有保护性作用。